1995 Fiscal Year Annual Research Report
インスリン依存性糖尿病特異的自己抗体のアッセイ系の確立と自己抗原の病因的意義
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06671040
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
森内 良三 長崎大学, 医学部, 講師 (60210142)
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| Keywords | ヒト膵臓ラ氏島β細胞 / cDNAライブラリー / GAD65 / レトロウイルスベクター / IP-Western法 / IDDM / 自己抗原 |
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| Research Abstract |
(1)ヒト膵臓ラ氏島β細胞由来のcDNAライブラリーからクローニングして得られたGAD65及びGAD67を大腸菌で産生させた。これらを抗原としてアッセイすると、抗血清とは強く反応するが患者血清とは殆ど反応しなかった。次にレトロウイルスベクターを用いてNIH3T3及びCHO細胞で発現させ、ウエスタンブロット法でアッセイしたが、大腸菌で作製したコンビナント蛋白を用いた場合と同様に患者血清とは反応しなかった。そこで最初にGADを発現させた細胞のライゼ-トを患者血清で免疫沈降し、SDS-PAGEで分離後抗血清を一次抗体としてウエスタンブロットを行った。この方法によりIDDM患者血清に特異的に反応するバンドを検出する事が出来た。すなわち患者血清は抗血清とは異なり、GADのリニアエピトープを認識しない。おそらく患者血清が認識するエピトープは三次構造をとることが示唆された。
(2)上記の方法、すなわち免疫沈降-ウエスタンブロット法(IP-Western法)を用いてIDDM患者血清中に存在する抗GAD抗体のアッセイ系を確立する事が出来た。現在IDDMの診断に応用されている。
(3)IDDM患者血清を用いてクローニングした他の自己抗原に関しては、全塩基配列を決定した結果、既知の遺伝子とはホモロジーがない事が判明した。現在この遺伝子の真核細胞での発現を予定している。
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[Publications] M.Yano,et.al.: "Autoantibodies against glutamic acid decar boxylase 65 in Japanese patients with insulin-dependent diabetes mellitus(IDDM)" Journal of Autoimmunity. 8. 83-96 (1995)
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[Publications] Kazuhiro Eto,et.al.: "Cloning of a complete protein-coding sequence of human platelet-type phosphofructokinase isozyme from pancreatic islet" Biochemical and biophisical research communications. 198. 990-998 (1994)
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[Publications] M.Yano,et.al.: "Establishment of Autoantibody Assay using Recombinant Human Islet Glutamic Acid Decarboxylase" Current status of diabetes melitus in East Asia. 89-92 (1994)
