1995 Fiscal Year Annual Research Report
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06671716
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
川嵜 良明 大阪大学, 医学部, 講師 (00224767)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川合 謙介 帝京大学, 医学部, 助手 (70260924)
土井 勝美 大阪大学, 医学部, 講師 (40243224)
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| Keywords | 内耳 / 虚血 / グルタミン酸レセプター / マイクロチュブール関連蛋白 / GluR2 / MAP2C |
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| Research Abstract |
1)虚血モデル動物の作製
Korpatchev(1982)らの方法により成熟ラットを用いて虚血モデル動物を作製した。開胸後心臓より上行する血管を圧迫し2-3分間血流を遮断し、さらに3分間心臓停止の状態を負荷することで全脳虚血を作製した。完全な心臓停止5-6分後に心臓マッサージと人工呼吸器による強制換気により脳循環を再開させ、自発呼吸を始めた動物はケージは戻された。
2)虚血モデル動物の内耳よりのmRNA抽出およびcDNAの作製
全脳虚血負荷後1-5日で動物を二酸化炭素ガスにて麻酔後断頭し中耳骨胞を摘出した。中耳骨胞より蝸牛を切り出して液体窒素中でホモゲナイズした後、GTC-CsTFA液中で超遠心分離にて内耳mRNAを抽出し、さらにmRNAから試験管内で逆転写酵素により相補的DNA(cDNA)を作製した。この際、虚血モデル動物の内耳と同様に正常動物の内耳よりもmRNAを抽出してcDNAを作製する。
3)虚血モデル動物の内耳cDNAのPCRによる増幅
脳でクローニングされたグルタミン酸受容体(AMPA型GluR1-4;KA型GluR5-7;NMDA型NMDAR1&2)、マイクロチュブール関連蛋白(MAP2b&c)およびNa^+-K^+ATPase(α&β)のcDNA塩基配列よりそれぞれに特異的な合成オリゴプライマーを作製した。虚血モデル動物および正常動物それぞれの内耳cDNAをテンプレートにして、PCR法によりこれらcDNAを増幅し、得られたcDNAを回収しその塩基配列を決定した。虚血モデル動物内耳に発現するグルタミン酸受容体では、AMPA型受容体のGluR1-48種類のサブユニットが確認され、またGluR2の発現が増加していた。マイクロチュブール関連蛋白では虚血モデル動物内耳においてMAP2cの発現が増加していた。・Na^+-K^+ATPaseに関しては現在検討中である。すなわち虚血モデル動物内耳においてこれらの蛋白質複合体に分子レベルでの構造的変化が起こっている可能性が示唆された。
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