ベーチェット病における連鎖球菌の関与および免疫異常に関する分子生物学的研究

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06671746
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 小竹 聡 北海道大学, 医学部・附属病院, 講師 (00186694)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉川 浩二 北海道大学, 医学部, 助手 (00250431)
• Keywords: ベーチェット病 / 連鎖球菌 / クローニング

Research Abstract

ベーチェット病患者由来Streptococcus sanguisから抽出した菌体DNAを制限酵素で切断ののち、λgt11ベクターにクローニングし、作成したライブラリーより、患者血清を一次抗体、抗ヒトIgGおよびIgM抗体を二次抗体とするイムノスクリーニングを行い、得た陽性クローンは、DNAとして約1.5kbpの大きさであり、Western blot法によりDNAの発現する蛋白は分子量33-35kDaであった。この得られたDNAの塩基配列の同定するため、まず単離したDNAのサブクローニングを行い、λgt11ベクターに入った菌体由来DNAを増幅後、EcoRIで切り出し、プラスミドpUC118に挿入し、この後、プライマー伸長法により、全塩基配列を決定した。その結果、1.5kbpの塩基配列の中にATGで始まるふたつのopen reading flame(ORF)と考えられる部分が存在しており、それぞれ590bpと950bpの大きさであった。Western blot法より抗原蛋白は分子量33kDa以上であったが、後者のORFはそのアミノ酸配列から推定して約34kDaの蛋白をコードしていると考えられ、また、16b上流にShine-Dalgarno配列を有していることから、後者のORFが抗原蛋白を発現している可能性が高いと考えられた。そこで下流領域をHindIIIおよびEcoRI CassetteおよびCassette primer^<【encircledR】>を用いたPCR法によってcloningし、さらに塩基配列の同定を行った。その結果、下流領域にstop codonが確認でき、抗原を発現していると考えられるopen reading frame(ORF)の全塩基配列が判明した。ORFは2,550bp、849のアミノ酸からなり、分子量は約94,800Daであった。Homology searchでは、ヒト網膜のganglion cellで発現しているhomeobox geneであるBrn-3bと高いhomologyがみられた。

Research Products

• [Publications] 吉川浩二: "ベーチェット病と連鎖球菌抗原" 日眼会誌. 100. 173-180 (1996)
• [Publications] Kotake,S.: "Clmical Study on patients with Bohcat's disease in Hokkaido" Ocular Jnmunol.Inflamm.3. 193-195 (1995)