1995 Fiscal Year Annual Research Report
破骨細胞の分化過程で特異的に発現している膜タンパク質の分離とその解析
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06671825
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| Research Institution | Meikai University |
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Principal Investigator |
羽毛田 慈之 明海大学, 歯学部, 助教授 (90164772)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
真野 博 明海大学, 歯学部, 助手 (20265359)
久米川 正好 明海大学, 歯学部, 教授 (40049367)
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| Keywords | 破骨細胞形成 / 破骨細胞特異抗体 / 破骨細胞特異膜抗原 |
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| Research Abstract |
前年度の本研究において、我々は5H抗原が破骨細胞様細胞の形成と平行して破骨細胞の前駆細胞に発現することを見いだし、5H抗原の精製を試みた。その結果、細胞質分画と細胞膜分画から純度約70〜90%のmain bandとして5H抗原を精製することができた。膜結合型5H抗原は約64kDa、細胞質5H抗原はゲル濾過上で約600kDa、SDS-PAGE上で約65kDaの分子量を持つ。そこで、本年度、細胞膜結合型5H抗原が不安定であることから、比較的安定な細胞質5H抗原のアミノ酸配列の分析を行った。精製された細胞質5H抗原をSDS-PAGEで分離した後、PVDF膜に転写したが、細胞質5H抗原が高度に糖鎖の修飾を受けているため転写効率が悪かった。わずかに転写された65kDaの5H抗原を直接プロテンシークエンサーにかけ、アミノ酸分析を行ったが、有意な配列情報は得られなかった。このことより、5H抗原はN末端が修飾されたタンパク質であることが予想された。そこで、PVDF膜に固定された65kDaのタンパク質を加水分解し、膜から遊離したペプチドフラグメントをHPLCで分離、それぞれのフラグメントのアミノ酸配列を分析した。その結果、4つのフラグメントの部分配列が解読された。そこでその部分配列をもとに既知のタンパク質のアミノ酸配列との相同性を分析した結果。一致するタンパク質は見あたらなかった。しかし、分析に供した5H抗原量が分析限界量付近であったため、いくつかの分析エラーが予想される。また、5H抗原の極度なN末端および糖鎖の修飾が致命的に分析を阻害していることから、現時点で5H抗原が、破骨細胞に特異的に発現される新規のタンパク質であると断定することはできない。以上の結果から、破骨細胞特異抗体5Hの抗原は、精製されたものの、その正体を明らかにすることは残念ながらできなかった。
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