PCR法を応用した歯周病原性細菌の特異的高感度検出法の確立と定量化の試み

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06671918
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 濱地 貴文 九州大学, 歯学部, 助手 (80198811)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 米田 雅裕 九州大学, 歯学部, 助手 (10253460) ; 廣藤 卓雄 九州大学, 歯学部, 講師 (10189897) ; 前田 勝正 九州大学, 歯学部, 教授 (00117243)
• Keywords: PCR / A.actinomycetemcomitans / P.gingivalis / 成人性歯周炎 / 歯肉縁下プラーク / 歯周病原性細菌

Research Abstract

本研究では歯周病原性細菌として注目されているA.actinomycetemcomitansとP.gingivalisをpolymerase chain reaction(PCR)法を用いて、歯肉縁下プラーク中より特異的に検出する方法を確立することを目的とした。PCR反応を行なうために、A.actinomycetemcomitansのロイコトキシン遺伝子の断片(396bp)と、P.gingivalisのコラゲナーゼ遺伝子の断片(414bp)を、それぞれ特異的に増幅するような2組のプライマーを合成した。A.actinomycetemcomitansとP.gingivalisの分離株を試料としてPCR反応を行ない、増幅産物の確認を、アガロースゲル電気泳動法により行なったが、その検出限界は、細菌細胞数で50〜100個まで検出することが可能で、従来のDNAプローブ法に比べて高い検出感度を示した。次に、成人性歯周炎患者より採取した歯肉縁下プラークを試料として、A.actinomycetemcomitansとP.gingivalisの検出を試みた。A.actinomycetemcomitansの検出率は68%、P.gingivalisの検出率は96%であり、従来の報告よりも高い検出率を示した。
A.actinomycetemcomitansとP.gingivalisの定量を行なうために、PCR用プライマーの5′末端を、ビオチンとジゴキシゲニンでそれぞれ標識した。標識プライマーを用いたPCR反応を行ない、その増幅産物をアビジンをコートしたマイクロタイタ-プレート上で、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を用いて発色反応により検出する方法の確立を試みた。A.actinomycetemcomitansもP.gingivalisもともに、標識したプライマーで特異的に増幅することができ、発色反応による検出感度は、アガロースゲル電気泳動法のそれと同等か、やや高かった。標識プライマーを用いたPCR法により、歯肉縁下プラーク中の歯周病原性細菌の検出と定量が行なえることが示唆された。