小ループS-S結合の役割・果して球状タンパク質リフォールディングの芯となりえるか

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06672149
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 酒井 朝也 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (00080169)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 栗本 英治 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (90234575) ; 黒田 良孝 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (40080204) ; 野原 大輔 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (60080214)
• Keywords: ジスルフィド結合 / N-ループS-S結合 / タンパク質のリフォールディング / タンパク質の折りたたみ / タンパク質の構造 / グルタチオン / サイトカイン

Research Abstract

これまでの研究において、小ループS-S結合を持つrhIL-6はrandom coil状態で酸化しても高収率に正しい酸化体が得られるが、複雑な副生成物が問題になること、高次構造形成後の酸化では反応の選択率は良くなるが、タンパク質濃度が高くなるとaggregatesが生成してしまうことを明らかにしてきた。本年度は副生成物の生成の抑制とその除去、および小ループ形成がrhIL-6の構造安定性とrefoldingに及ぼす効果についての実験を行った。
酸化過程での副生成物のほとんどはS-Sスクランブル反応による多量体である。これを抑制するために、glutathioneによるredox bufferの添加効果を調べた。その結果、高次構造形成後の酸化では、タンパク質濃度が0.05mg/mlと低い場合には副生成物の生成はほとんど認められなくなり、ほぼ100%の効率で正しい酸化体が得られた。しかし、タンパク質濃度が0.5mg/mlと高い場合には、aggregatesが生成してしまった。一方、random coil状態での酸化においてもredox bufferの添加によりS-Sスクランブル反応による多量体生成が抑制できることが分かり、0.5mg/mlの高タンパク質濃度でも約90%の収率で正しい酸化体を得ることに成功した。その場合、複雑な副生成物を完全に抑制することはできなかったが、陽イオン交換クロマトグラフィーによりこの副生成物は容易に除去できることが明らかとなった。このようなrandom coil状態でも形成可能な小ループS-S結合でも、その形成によりrhIL-6の塩酸グアニジンに対する構造安定性を高め、またrefoldingも容易になることも明らかとなった。このことから小ループS-S結合をタンパク質に新たに導入することにより、そのrefoldingの効率を高める手法の有効性が示唆された。