1994 Fiscal Year Annual Research Report
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06680585
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
乗岡 茂巳 大阪大学, たんぱく質研究所, 助手 (70198638)
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| Keywords | リジルエンドペプチダーゼ / 基質特異性 / 部位特異的変異 / タンパク質工学 / 水素結合 |
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| Research Abstract |
APIとTLCKとの複合体の立体構造から、基質リジン側鎖のε-アミノ基との水素結合可能な残基、Thr189とSer214に的を絞り、部位特異的変異により水素結合を形成できない変異体を作製し、APIのリジン特異性に対する水素結合の重要性を検討した。作製した変異体はThr189をVdlに置換した[T189V]、Ser214をAlaに置換した[S214A]、そして両変異を合わせ持った[T189V,S214A]の3種類である。Boc-Vdl-Leu-Lys-MCA基質に対する動力学定数を求めたところ、3種類の変異体のKcat値は野生型と殆ど変わらず,Km値はシングル変異体で約10倍、ダブル変異体で約100倍増加した。またTLCK、DFP、PMSFに対する阻害実験からも3種類の変異体は、catalytic triadを中心とした触媒部位の機能は野生型と変化なく、基質結合部位の基質結合能の低下のみ観察された。以上の結果、Thr189とSer214が基質リジン側鎖と形成する水素結合の基質結合能における役割の定量的評価に成功した。
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[Publications] Shigemi Norioka: "Identification of three catalyfie tviad constituents and Asp-225 essential for function of lysire-specific sorine protease,Achromobacter protease I." J.Biol.Chem.269. 17025-17029 (1994)
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[Publications] Shigemi Norioka: "Site-directed mutagenic study of the substrate specificity of Streptomyces erythraeus trypsin-like protedse." Protein Engineering. 7. 1153-1154 (1994)
