精製した転写因子を用いたP4501A1遺伝子の誘導的発現のインビトロ解析

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06680601
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 十川 和博 東北大学, 理学部, 助教授 (80175421)
• Keywords: Ahリセプター / Arnt / Sp1 / バキュロウイルス発現系 / RNAポリメラーゼ

Research Abstract

P4501A1遺伝子の転写に必要な三つの転写因子Ahリセプター、Arnt、Splをバキュロウイルスの発現系を使って調製した。得られた粗抽出物をさらにニッケルアルフィニティークロマトグラフィーでさらに精製した。この操作で5x10^8の細胞から20μgのAhリセプター、80μgのArnt、80μgのSp1をそれぞれ純度20%,80%,80%で得ることができた。またSp1についてはHeLa細胞核抽出液からも分離精製した。これらの因子とその特異性抗体を使ってSp1とAhリセプター、Sp1とArntが結合することを見いだした。さらに、これらの精製因子と、AhリセプターとArntのヘテロダイマーが認識するXREを4個、Sp1が認識するGCボックスを1個プロモーターにもつGフリーカセットをテンプレートに使ってインビトロ転写実験を行った。基本転写因子群はRNAポリメラーゼを含むHeLa細胞の核抽出液で、すでにわかっているSp1の転写効果をまず検討したところ、バキュロウイルス発現系で調製したSp1よりもHeLa細胞由来のSp1の方が転写活性が強かった。バキュロウイルス発現系のSp1はコンフォメーションが十分でない可能性がある。つぎにAhリセプター、Arntの添加効果を調べたところSp1のみに比較して約2倍の転写活性化を観察した。Ahリセプター、Arntだけでは転写活性化はおきなかった。これらの結果は動物実験や培養細胞でのP4501A1遺伝子のAhリセプターとArntを介した転写活性化(約30倍)には及ばないものの3個の転写因子の寄与を確認したことになり、一定の成果を得ることができた。

Research Products

• [Publications] M.Ema: "Human Arylhydroearbon Receptor:Functional Expression and Chromosmal Assignment to 7 p21" J.Biochem.116. 845-851 (1994)
• [Publications] M.Ema: "Dioxin Binding Activities of Polymorphic Forms of Mouse and Human Arylhydrocarbon Receptors" J.Biol.Chem.269. 27337-27343 (1994)
• [Publications] J.Mimura: "A Complete Structure of the Ah Receptor Gene" Pharmacogenetics. 4. 349-354 (1994)
• [Publications] A.Kobayashi: "Analysis of Functional Domains of a GC Box-Birding Protein,BTEB" J.Biochem.117. 91-95 (1995)
• [Publications] K.Sogawa: "Possible Function of Ah Receptor Naclear Translodtor(Arnt)homaodimer in Transciptional Regulation" Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (in press).