アミノ基転移反応におけるシッフ塩基の反応性を保証する酵素構造の検索

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06680619
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 棚瀬 純男 熊本大学, 医学部, 助教授 (20112401)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 桧垣 強 熊本大学, 医療技術短期大学部, 助教授 (70128304)
• Keywords: タンパク質工学 / 部位特異的突然変異 / アミノ基転移 / 補酵素 / 核磁気共鳴 / ヒスチジン残基 / 遺伝子工学 / シッフ塩基

Research Abstract

補酵素結合部位を弧状に取り巻きPLPと水素結合する残基間のネットワーク(PLP-N1,Asp222,His143,Thr139,His189,Ser136,His193,Asn194,Tyr225,PLP-03')の一部を構成するHisクラスターが共同して活性域内荷電状態の安定性を保ち、シッフ塩基の反応性を増加している可能性を明らかにするため、ブタ酵素変異体を作成し、変異酵素の諸性質を野性型酵素と比較検討した。
1.His143,His189,His193をそれぞれ、最も構造的に近いが荷電を持たないGlnに置換した変異酵素を作成した。
2.変異酵素の動力学的性質を野性型酵素のそれと比較したところ、基質に対する親和性を若干減少していたが、反応速度に変化は見られず、触媒活性に大きな差異は観察されなかった。
3.変異酵素の吸収およびCDスペクトルを解析し、補酵素PLP結合に関する情報を得た。His189をGlnに置換した酵素では、シッフ塩基のpK値が大きく上昇していたが、他の変異酵素は野生型酵素と同様の吸収スペクトルを示した。
4.変異酵素のNMRスペクトルを解析し、野性型酵素におけるHis189ピークの帰属を決定した。His189に由来するシグナルは、pHによる化学シフト変化をほとんど示さなかった。His143Gln,His193Gln変異酵素におけるHis189の化学シフト位置が野生型酵素のそれと異なることから、3つのHis残基間に相互作用があると考えられた。
5.米国Arnone,Metzler研究室と共同でX線による変異酵素の全体構造の解析を行なっている。

Research Products

• [Publications] K.Nishimura: "Functional roles of the amino-terminal mobile segment in catalysis by porcine cytosolic aspartate aminotransferase:Critical importance of Val^<17> and Phe^<18> for productive binding of substrates." J.Biol.Chem.269. 24712-24718 (1994)
• [Publications] D.E.Metzler: "NMR studies of ^1H resonances in the 10-18-ppm range for cytosolic aspartate aminotransferase" J.Biol.Chem.269. 28017-28026 (1994)