糖質のポリアクリルアミド電気泳動法を用いた糖質分解酵素の基質特異性の研究

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06760070
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 吉田 滋樹 筑波大学, 応用生物化学系, 助手 (90230739)
• Keywords: 糖質分解酵素 / 基質特異性 / ポリアクリルアミド電気泳動 / オリゴ糖

Research Abstract

1.各種オリゴ糖の調製
クマイザサ及び広葉樹キシランを酵素分解して得た糖液から、活性炭カラム、ゲル濾過、ペーパークロマトグラフィー等により各種オリゴ糖を分離した。その結果、DP=1〜10のキシロオリゴ糖、DP=3〜6のアラビノキシロオリゴ糖、DP=4〜7のグルクロノキシロオリゴ糖が得られた。
2.ANTS標識及びポリアクリルアミド電気泳動法によるオリゴ糖の分析条件の検討
調製した各種オリゴ糖を常法によりANTSで標識した後、様々な条件下でポリアクリルアミド電気泳動法による分析を行った。その結果、30〜40%のポリアクリルアミドグラジエントゲルを用いて400Vの定電圧で泳動することにより、DP=1〜15程度のオリゴ糖が分離できることが明らかとなった。さらに、ゲル濃度を40〜50%にした場合、全体的にサンプルの移動度は小さくなるが、各オリゴ糖の構造の差異が移動度により大きく影響した。また、グルクロン酸を含むオリゴ糖では、糖自身の電荷により中性糖よりその移動度がかなり大きくなった。一方、この分析法によるオリゴ糖の検出感度は、従来オリゴ糖の分析に用いられている薄層及びペーパークロマトグラフィーに比べて格段に高く、1nmolで明瞭なバンドが得られ、100pmolでも検出が可能であった。
3.Streptomyces olivaceoviridis E-86由来のβ-1,4-キシラナーゼの基質特異性の検討
クマイザサキシランにStreptomyces olivaceoviridis E-86由来のキシラナーゼを作用させ、その反応生成物の経時変化を前述したポリアクリルアミド電気泳動法で分析した。その結果、反応初期にはDP=15〜20のオリゴ糖が生成し、これがさらに酵素により分解され低分子のオリゴ糖が生成するという本酵素の作用様式が明らかとなった。またこの電気泳動法がエンド型糖質分解酵素の特異性研究に有効な分析法であることが示された。