糖脂質シアル酸転移酵素の単離精製

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06770095
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 笠原 浩二 財団法人東京都臨床医学総合研究所, 生命情報研究部門, 研究員 (60250213)
• Keywords: ガングリオシドGM3 / GM3合成酵素 / 糖脂質シアル酸転移酵素

Research Abstract

糖脂質シアル酸転移酵素は膜内在性の酵素であること、抽出した酵素が不安定であること、活性測定が繁雑であることなどから、精製の成功しているものは数少なく、その生化学的性質はあまり分かっていない。本研究では、簡便な糖脂質シアル酸転移酵素活性測定法を開発しそれを用いて、GM3合成酵素の単離精製を試みた。
逆相薄層クロマトグラフィーとバイオイメージングアナライザーを組み合せた活性測定法で、これまで1日要していた活性測定が3-4時間程度で行なえるようになり、失活しやすい本酵素には有効であった。本方法を用い豚各臓器の比活性を測定したところ、顎下腺に豊富に含まれていることが分かり同臓器を精製材料に選んだ。抽出に用いる界面活性剤を検討したところ、Triton X-100で効率よく抽出できることが分かった。抽出した酵素を安定化する因子を検討したところ、10%グリセロールと1mMCDPが効果的であった。各種アフィニティークロマトグラフィーを検討したところ、陽イオン交換クロマトグラフィー(P11 Phosphocellulose)、色素アフィニティークロマトグラフィー(Blue Sepharose)、レクチンアフィニティークロマトグラフィー(ConA Sepharose)、基質固定化アフィニティークロマトグラフィー(LacCer column)で効果的に部分精製できることが分かり、比活性をそれぞれ約5、3、5、30倍上げることができた。酵素の性質を調べたところ、金属イオンは要求せず、至適pHは6、Km値はCMP-NeuAcが270μM、LacCerが19μMだった。

Research Products

• [Publications] Kasahara,K.et al.: "Enzymatic assay of glycosphingolipid sialyltransferase using reverse-phase thin-layer chromatography" Anal.Biochem.218. 224-226 (1994)
• [Publications] Nara,K.et al.: "Expression cloning of a CMP-NeuAc:NeuAcα2.3Galβ1,4Glcβ1,1'Cer α2.8-sialyltransterase(GD35ynthase)from human melanoma cells." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91. 7952-7956 (1994)
• [Publications] 笠原浩二: "BIOSCIENCE SERIES ストレス蛋白質-基礎と臨床" 中外医学社(永田和宏編), 266 (1994)
• [Publications] 笠原浩二: "バイオマニュアルUPシリーズ分子生物学研究のための培養細胞実験法" 羊土社(黒木登志夫、許南浩 千田和広編), 243 (1995)