遺伝子操作によるウエルシュ菌α毒素の亜鉛結合部位と作用の解析

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06770211
• Research Institution: Tokushima Bunri University
• Principal Investigator: 永浜 政博 徳島文理大学, 薬学部, 助教授 (40164462)
• Keywords: ウエルシュ菌 / α毒素 / ホスフォリパーゼC / 部位特異変異法 / ヒスチジン / 亜鉛 / リガンド / 金属タンパク質

Research Abstract

ウエルシュ菌α毒素は、致死、壊死、溶血、ホスホリパーゼC(PLC)活性等を示す。α毒素は、分子内にZnを有する金属タンパクで、Znが活性発現に重要であることが報告された。一方、α毒素のアミノ酸配列と相同性が高いセレウス菌PLCのX線解析から、α毒素は分子内に3個のZnが存在し、それらは特定のHis残基を含むのアミノ酸残基にリガンドされていると推察された。今回、毒素分子中に存在する9個のHis残基すべてを部位特異変異法でGlyに置換した変異毒素遺伝子を作成し、枯草菌を用いて発現、精製後、α毒素と各変異毒素の活性を比較し、各His残基の役割を解析した。その結果、H68G、H126G、H136G、H148Gの変異毒素は、溶血、致死、PLC活性が著しく減少したが、46、207、212、241位のHis残基の変異毒素は活性の変化は認められず、H11Gは毒素の発現が認められなかった。このうち、α毒素とH148Gは、3mM Ca存在下で赤血球膜に結合したが、H68G、H126G、H136Gは結合せず、さらに、H148Gは本毒素の溶血活性を阻害した。α毒素、H68G、H126G、H136Gは分子内に2個のZnを有していたが、H148Gは1個であった。一方、^<65>Znはα毒素とH148Gに結合したが、H68G、H126G、H136Gには結合しなかった。以上の結果から、α毒素の68、126、136、148位のHis残基は毒素活性発現に重要なZnのリガンドであると考えられる。このうち、68、126、136位のHis残基は、はずれやすい3番目の金属イオンのリガンドで、毒素の結合に重要であると考えられ、148位のHis残基の結合には関与せず、作用発現に重要な2番目のZnの強力なリガンドであると思われる。一方、H11Gは発現しないことから、11位のHis残基は、毒素の構造維持に重要な1番目のZnのリガンドと推察される。

Research Products

• [Publications] M.Nagahama,H.Iida,E.Nishioka,K.Okamoto and J.Sakurai: "Roles of the carboiy-terminal region of Clostridium perfringens alpha toxin." FEMS Microbiol.Lett.120. 297-302 (1994)
• [Publications] 櫻井純,永浜政博,越智定幸: "ウエルシュ菌α毒素の作用" 日本細菌学雑誌. 49. 719-736 (1994)
• [Publications] M.Nagahama,Y.Okagawa,T.Nakayama,E.Nishioka and J.Sakurai: "Site-directed mutagenesis of histidine residues in Clostridium perfringens alpha-toxin" J.Bacteriol.177. 1179-1185 (1995)