1994 Fiscal Year Annual Research Report
E群色素性乾皮症相補因子の分離・同定とDNA損傷結合蛋白質との相関性について
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06780439
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
朝比奈 宏 神戸大学, 医学部, 助手 (70243300)
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| Keywords | 色素性乾皮症 / DNA修復 / 無細胞(in vitro)系 |
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| Research Abstract |
E群XP相補活性の同定のために、まず無細胞(in vitro)におけるDNA修復系をセットアップした。1988年にWoodらにより開発されたUV照射したプラスミドへの標識されたデオキシヌクレオチドの取り込みにより検出するin vitro-DNA修復合成系をもとに、pBR322とpUC19の2つの大きさの異なるプラスミドを調製し、分子量の小さいほうのpUC19に450J/m^2の紫外線を照射した。これら2つのプラスミドを等しい分子数になるように混ぜ(89fM,どちらも約0.25μg)、ビオチンでラベルされたデオキシヌクレオチド(dUTP)やATP産生系(phosphocreatineとcreatine phosphokinase)の存在下に培養細胞から調製した抽出液と反応させる。30℃で3hr反応後、プラスミドを制限酵素で一ケ所切断しアガロースゲルで電気泳動する。泳動後ブラスミドDNAをゲルからナイロンメンブレンに写し発光処理をしてからX線フィルムにはさむが、DNA修復能はX線フィルムに焼き付けられるバンドの濃さに反映される。コントロールとして正常細胞であるGM637Fから得た抽出液を用いた結果、紫外線照射したプラスミドにはビオチン -dUTPが多数取り込まれるが、照射しないものにはほとんど取り込まれないことを確認した。そしてE群XP細胞であるXP43TOSVとXP82TOSVから抽出液を調製しin vitro DNA修復系での反応を試みたが、紫外線照射したプラスミドへのラベルの取り込みがかなり見られるので(通常XP細胞除去修復能欠損細胞なのでラベルの取り込みが少ないか全く無い)、正常細胞を含め最適条件について検討中である。
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