1994 Fiscal Year Annual Research Report
ビタミンD_3代謝酵素の分子生物学的研究(25-ヒドロキシビタミンD_323-水酸化酵素の同定)
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06780507
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
大山 義彦 広島大学, 理学部, 助教授 (30169081)
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| Keywords | ビタミンD_3 / 活性型ビタミンD_3 / チトクロムP-450 / 25-ヒドロキシビタミンD_3 24水酸化酵素 / 25-ヒドロキシビタミンD_3 23水酸化酵素 / 酵素誘導 / ビタミンDレセプター |
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| Research Abstract |
ラットでは,25-ヒドロキシビタミンD_324-水酸化酵素は活性型ビタミンD_3(1,25(OH)_2D_3)により著しく誘導される。そのメカニズムとして,1,25(OH)_2D_3がビタミンDレセプター(VDR)に結合した後,RXRとダイマーを形成し,それがプロモーター領域にあるビタミンDレスポンスエレメント(VDRE)に結合し転写を活性化することを明らかにした。この24-水酸化活性はラット,マウスで顕著であり,モルモットなどの動物種では23-水酸化活性が認められ24-水酸化活性は非常に低い。しかし,2つの酵素の誘導,生理的役割と,チトクロムP-450の酵素の性質を考え合わすと,2つの酵素は同じファミリーである可能性が高い。そこで,24-水酸化酵素のcDNAを用いて23-水酸化酵素cDNAライブラリーをスクリーニングした。
4週齢のモルモットに2.5μg/日の1,25(OH)_2D_3を2日連続投与し,腎臓からmRNAを調製した。ラットのcDNAのコーディング領域をプローブとしnorthernblottingを行った結果,ラットより僅かに小さい3.2kbのバンドが検出できた。したがって,モルモットにもラットの24-水酸化酵素と相同性を持つ遺伝子が存在することが明らかとなった。さらに,このmRNAは活性型ビタミンD投与により誘導されることから,モルモットの24-,または23-水酸化酵素であることが期待される。そこで,クローニングためにmRNAのサイズ分画を行い,oligo(dT)プライマーによりcDNAを合成しλgt10を用いライブラリーを作製した。およそ30万のプラークをスクリーニングしたところ,6つのポジティブシグナルが得られた。しかし,これらのクローンのインサートサイズは0.9〜1.2kbpとnorthernblottingから予想されたものより小さかった。
現在,この6つのロリーンの塩基配列の決定,新たにランダムプライマーを用いたcDNAライブラリーの作製,5´-RACE法を進めている。
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Research Products
(6 results)
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[Publications] 大山義彦: "ラットのビタミンD24-水酸化酵素遺伝子プロモーター領域のビタミンDレスポンスエレメントの機能解析" 第10回ビタミンDワークショップ プログラム抄録集. 20-21 (1994)
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[Publications] 大山義彦: "ビタミンD作用と代謝に関わる遺伝子とその異常" Clinical Calcium 3月号 骨病変と遺伝子異常 医薬ジャーナル社. 17-22 (1995)
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[Publications] 須田立雄: "Differences of the regulation of 24-hydroxylase gene expression in the kidney and intestin." Vitamin D;proceeding of the Ninth workshop on Vitamin D,Walter de Gruyter. 113-121 (1994)
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[Publications] 秋吉恵: "Further oxidation of hydroxycalcidiol by calcidiol 24-hydroxylase" Eur.J.Biochem.224. 335-343 (1994)
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[Publications] 西村篤: "Regulation of messenger ribonucleic acid expression of H,25-dihydroxyvitamin D_3-24-hydroxylase in Rat osteoblasts." Endocrinology. 134. 1794-1799 (1994)
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[Publications] 大山義彦: "Identification of a vitamin D-responsive element in the 5´-flanking region of the rat 25-hydroxy vitamin D_3 24-hydroxylase gene." the Journal of Biological Chemistry. 269. 10545-10550 (1994)
