小胞体膜蛋白質膜透過チャネルを構成する蛋白質の解析

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06780510
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 阪口 雅郎 九州大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (30205736)
• Keywords: 蛋白質 / 膜透過 / 細胞主物学 / 小胞体膜

Research Abstract

小胞体における蛋白質の透過チャネルを構成すると考えられる小胞体膜蛋白質の候補として、架橋反応によって、低分子量膜蛋白質(Cp9)を同定していた。以下のごとく、Cp9の候補として、イヌ膵臓粗面小胞体から9kDaの膜蛋白質を単離精製した。即ち、イヌ膵臓から生化学解析に耐えうる充分量の粗面小胞体膜をショ糖密度勾配遠心法によって精製しin vitroにおける蛋白質透過活性の高いことを確認した。この粗面小胞体膜をジギトニン処理によって穏やかな条件で可溶化した後、リボソーム・蛋白質膜透過装置複合体を超遠心分画法により濃縮した。その後、ジギトニン存在化の高濃度の塩処理によって同複合体膜蛋白質を解離させ、リボソームから解離可溶化し、リボソームを超遠心によって除いた。この複合体には、9kDa蛋白質が主要成分として含まれていたのでこれをCp9の候補と考え、調製用SDS-電気泳動法を用いて単離した。精製された蛋白質を、アスパラギニルエンドペプチダーゼ、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼで消化後、ペプチド断片をC18逆相カラムを用いたHPLCによって単離し、それぞれの部分アミノ酸配列を決定した。この配列を元にして、15アミノ酸からなる合成ペプチドを作成し、ウシ血清アルブミンに化学架橋反応によって結合させ、ウサギに免役し抗血清を得た。抗血清から合成ペプチドを結合した樹脂を用いて、特異抗体を精製し、免疫沈降法によってCp9との反応性を調べたが沈降しなかった。しかし、蛋白質膜透過チャネルの成分の一つが単離及び構造決定できたと考え、現在機能解析を進めている。

Research Products

• [Publications] R.Alam: "cDNA cloning and characterization of mitochodrial import stimulation factor(MSF)purified from rat liver cytosol." J.Biochem.116. 416-425 (1994)
• [Publications] N.Hachiya: "MSF,a novel cytoplasmic chaperone with the function of precursor targeting to mitochondria." EMBO J.13. 5146-5154 (1994)