FACSを用いて単一細胞中の特異的mRNAを検出するための蛍光ISH法に関する研究

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06806037
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 長谷川 貴史 宮崎大学, 農学部, 助教授 (10237969)
• Keywords: ISH / mRNA / クエンチング / サイトカイン / フローサイトメーター

Research Abstract

フォトビオチンでラベルしたcDNAを用いて単一細胞中のサイトカインmRNAをフローサイトメトリーで検出する方法を検討した。in situハイブリダイゼーション法(ISH)は申請者がすでに報告している方法を一部改良して用いた。LPS刺激マウス腹腔マクロファージにはIL-1とTNFのmRNAがフィルターハイブリダイゼーションで確認されたため,ISHを行った。具体的には、培養細胞を4%パラフォルムアルデハイドで固定した後、Triton-XとH_2O_2で処理した。さらにビオチン化プローブを含んだハイブリダイゼーションバッファーと熱変性させてから一晩ハイブリダイゼーションを行った。洗浄の後発色過程に移行した。発色にはFITCを使用したが、蛍光顕微鏡で確認したところ全細胞に特異的蛍光は見られなかった。さらに蛍光が認められた少数の細胞においてもその発色強度はあまり強いものではなかった。むしろ細胞質や細胞膜に非特異的にみられた蛍光(バックグラウンドの蛍光)のほうが強いようであった。この非特異蛍光を消去するためにトリパンブルーを用いてクエンチング処理をほどこしたところ、非特異蛍光はある程度抑えられ本方法の有用性が示唆された。しかしながら、目的とした特異蛍光の強度も同時に減弱されるようであった。この傾向はクエンチング処理時間が長いほど顕著であった。そこで本学で発色過程を行った後直ちにクエンチング処理をほどこすのではなく、フローサイトメーター(FACS)での検査依頼のために輸送する直前にそれを実施するようにした。FACS検査は福岡の日科機に依頼して行ったが、有為に特異蛍光が検出できた例はなかった。若干蛍光強度のピークが右方に移動することはあったが、バックグラウンドのそれとオーバーラップする領域でありさらに方法論と測定法を検討する必要があるものと思われる。