継代ラット伊東細胞のI型コラゲンα1鎖mRNAレベルの調節因子の解析

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06807010
• Research Institution: Toyama Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 平賀 紘一 富山医科薬科大学, 医学部, 教授 (40004733)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森ケ崎 進 富山医科薬科大学, 医学部, 助手 (90242487)
• Keywords: I型コラゲンα1鎖

Research Abstract

1)本年度の研究計画に従い、まず、I型コラゲンα1鎖遺伝子の単離を試みた。ラット肝にはスプライシングの位置の違いにより生じる2種のCo|1A|mRNA(4.5kbと5.7kb)が存在する。現在、これらに対する全長のcDNAは得られていない。我々はKream等により得られた蛋白コード領域の3′側約1.6kbのcDNAクローンpα1R1を予備的研究に使ったが、遺伝子構造の解析のためにはマウスの本蛋白質cDNAとの比較だけで不十分であるので、pα1R1の5′端の配列を合成DNAプライマーとして新たに特異的cDNAを合成し、ライブラリーを作った。I型コラゲンα1鎖mRNAの構造はおそらくグリシン、プロリンに富む蛋白の一次構造の特徴によりcDNAの伸長が十分起こらない程度にGCに富むと思われる。このため、cDNAライブラリーの作成に時間を要した。動物の種によらずI型コラゲンα1鎖の全構造が明らかにされた例はないから、今後、pα1R1の5′端の配列をプローブとしてCo|1A|cDNAを単離し、この蛋白の構造を解明する。ラットゲノムライブラリーは既に作ったので、Co|1A|遺伝子も同時に単離する。この遺伝子も第一エクソンとその上流のプロモーター領域だけしか知られていないので構造を決める。
2)Co|1A|mRNAの分解速度と単離核でのRun-on転写活性:継代培養伊東細胞の単離核を[α^<-32>P]UTPを含むRun-on転写系で反応させると、pα1R1cDNAをプローブとして産物を検出できた。一方、正常肝のすべの細胞から調製した核ではシグナルを殆ど検出できず、正常肝から分離直後の伊東細胞の核のそれは検出できたが非常に弱い。この糸での結論を得る見通しはついたので、α-アマニチンかアクチノマイシンDを腹腔投与したラット肝と、これらを培地に添加し短期間培養した継代伊東細胞のtotal RNAを使い、Northern法で検出されるシグナルの放射活性から、Co|1A|mRNAの半減時間を求める実験にもとりかかる。