大腸菌発現アンドロゲンレセプター結合法による顎下腺EGF遺伝子転写調節領域の解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06807144
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 根本 孝幸 岩手医科大学, 歯学部, 講師 (90164665)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 客本 斉子 岩手医科大学, 歯学部, 助手 (90118274)
• Keywords: 顎下腺 / アンドロゲンレセプター / アンドロゲン応答配列 / EGF / HSP90 / 二量体化

Research Abstract

昨年度作成したアンドロゲンレセプ-(AR)のDNA結合ドメイン-グルタオチンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質(GST-ARDBD)を用いてマウスEGF遺伝子のアンドロゲン応答配列の同定を試みた。初めにアンドロゲン応答配列をもつマウス乳腺癌ウイルス(MMTV)のlong terminal repeat配列とARDBDとの結合を測定した。その結果、ARDBDは対照のpUC18よりも選択的にMMTV long terminal repeatと結合した。そこでこのカラムを用いてクローン化したマウスEGF遺伝子のプロモーターとその5'上流配列との結合を測定したところ、-896〜-433の領域がARDBDと非常に強く結合することが認められた。この領域をさらに3等分してPCR増幅しさらに検討したところ、そのうち-727〜-598までの130bがARDBDと強く結合することがみいだされた。この塩基配列中には、同様にマウス顎下腺や前立腺でアンドロン依存的に発現が制御されている遺伝子と非常に類似する領域が見いだされこの部分がAREである可能性が高い。
私たちは以前にステロイドレセプター結合因子であるHSP90が、レセプターのDNA結合活性のみならず、ステロイド結合活性をも制御していることを明らかにした。本年度はさらにHSP90自身のダイマー形成様式とステロイドレセプター結合様式について検討した。その結果、互いに逆向きに配向したC-末端領域(Met628/Ala629-Asp732)とそのN末端側の領域(Val542-Tyr627)が二重に結合することによってダイマー構造をとることが明らかとなった。さらにこのダイマー形成領域のうち、HSP90βアイソフォームではアミノ酸561-685間に存在する16アミノ酸残基の置換によってダイマーが解離しやすくなっていた。一方、ステロイドレセプターとの結合領域は少なくとも290番目のアミノ酸以降に存在していた。

Research Products

• [Publications] Nemoto, T. et al.: "Mechanism of dimer formation of the 90-kDa heat shock protein." Eur. J. Biochem.223. 1-8 (1995)
• [Publications] Nemoto, T. et al.: "Identification of proteins by use of glutathione S-transfearse fusion system." Anal. Biochem.227. 396-399 (1995)
• [Publications] Nemoto, T. et al.: "Kinship between self-oligomerization and the estrogen receptor-interacting activities of the 90/kDa heat shock protein." Steroid Biochem. (Life Sci. Adv.). in press.
• [Publications] Nagai, M. et al.: "Reduction of androgen receptor mRNA concentration by testosterone in mouse submandibular gland." Endocrine J.42. 31-38 (1995)
• [Publications] 八木一弘 他: "マウス顎下腺アンドロゲンレセプターの精製とその性質の検討" 岩手歯学会誌. 20. 16-25 (1995)
• [Publications] 客本斉子 他: "ヒト顎下腺細胞株(HSG)におけるRXRファミリーの発現" 口腔組織培養研究会誌. 4. 55-65 (1995)
• [Publications] Nemoto, T. et al.: "Dimarization characteristics of the DNA- and steroid-binding domains of the androgen receptor." J. Steroid Biochem. Mol. Biol.50. 225-233 (1994)
• [Publications] Ema, M. et al.: "Human arylhydrocarbon receptor: functional expression and chromosomal assignment to 7p21." J. Biochem.116. 845-851 (1994)
• [Publications] Nagai, M., et al.: "Mobility of digoxygenin-dUTP polymerase chain reaction products and detection of single-stranded products in agarose gel." Anal. Biochem.211. 208-210 (1994)