1994 Fiscal Year Annual Research Report
骨形成因子(BMP)によって誘導される初期遺伝子の解析
| Project/Area Number |
06807156
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
|---|
Principal Investigator |
朝比奈 泉 東京医科歯科大学, 歯学部, 助手 (30221039)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大井田 新一郎 東京医科歯科大学, 歯学部, 助手 (10114745)
|
|---|
| Keywords | 骨形成因子 / 骨芽細胞 / 分化 |
|---|
| Research Abstract |
培養細胞として骨芽細胞様細胞株MC3T3-EIおよび骨髄由来幹細胞株ST-2を用い、これにOP-1(BMP-7)をそれぞれ6時間、24時間作用させた後、AGPC法にてtotal RNAを調製した。
Differential Display System(RNA map)のプロトコールに従い、このRNAの逆転写産物を予め用意された20種類の組み合わせのプライマーを用いて35S-ATPの存在下でPCRを行い、約100〜300bpの種々のDNAフラグメントをラベリングした。
これを電気泳動によってシークエンスゲル上に展開し、オートラジオグラフィにてOP-1を作用させたものとコントロールについてバンドを比較し、明らかに差異を認める66のDNAフラグメントを抽出、これをサブクローニングし、塩基配列の解析を行った。
その結果、ユビキチン、14-3-3蛋白質等いくつかの既知の遺伝子とホモロジーの高い遺伝子が存在することがわかった。
このようにして得られたプローブが、OP-1を作用させた細胞とコントロールの細胞間において異なった発現を示すかどうかを検証するために、新たにMC3T3-E1,ST-2およびC2C12細胞株を培養し、OP-1をそれぞれ6時間、12時間、24時間作用させた後totalRNAを調製し、このRNAからmRNAを精製、これを用いてドット・ブロッティングを行った。
32P-dCTPの存在下でPCRにてプローブのラベリングを行い、このプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。
|
-
[Publications] Y.Maruoka.I.Asahina et.al: "Production of Functional Human Bone Morphogenentic Protein-2 Using A Baculovirus/SF-9 Cell System." Biochem. Mol.Biol.Int.in press. (1994)
-
[Publications] J.C Maliakal.I.Asahina et al.: "Osteogenic Protein-1(BMP-7) Fnhibits Cell Prolifevation and Stimulates the Expression of Markers Characteristics of Osteoblast Phemotype" Grouth Factors. 11. 227-234 (1995)
-
[Publications] K.Takeda,S.Oida et al: "Molecular Cloning of rat bone inorphogenetic Protein(BMP)Type IA receptor and its expression during ectopic bone formation" Biochem Biophys.Res.Commun.204. 203-209 (1994)
-
[Publications] T.Iimura,S.Oida et al: "Modulation of responses to TGF-β by 1,25-Dihydvoxy v.tamin D_3 in MG-63 osteoblastic cells" Biochen.Biophys.Res.Commur.204. 918-923 (1994)
