マクロファージ由来LPS耐性変異株からのLPS耐性遺伝子の分離と解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06807171
• Research Institution: NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH
• Principal Investigator: 天野 富美夫 国立予防衛生研究所, 細胞化学部, 主任研究官 (90142132)
• Keywords: マクロファージ / リポ多糖(LPS) / 耐性遺伝子 / 変異株

Research Abstract

J774.1マクロファージ細胞株へのhygromycin耐性遺伝子の導入を試みたが、リン酸カルシウム法も電気パルス法も、いずれも成功しなかった。遺伝子導入は本研究目標の達成にとって非常に重要な技術であるので、繰り返し、試みたが、現在までのところ、上手く行かない。いずれの場合にも、遺伝子導入の可能な条件では細胞が生存できず、また、細胞の生存が可能な緩和な条件下では、遺伝子は導入されなかった。そこで、他の研究者の予備実験が成功したという報告のある、別のマクロファージ系細胞株、RAW264.7細胞に遺伝子導入する方向で、現在、検討を加えている。
一方、LPS耐性細胞のスクリーニング及び選別の過程に関し、本年度の研究によって、大きな進展が見られた。すなわち、従来の方法では、LPS耐性をコロニー形成法で調べていたため、結果の判定までに約7日間の細胞培養が必要であった。これに対し、本年度新たに見いだした、シクロヘキシミド存在下にLPSを添加して培養する方法により、J774.1細胞由来のLPS感受性細胞株、JA-4細胞は37℃、4時間の培養で50%以上が障害されて死ぬことが判った。これに対し、LPS耐性細胞株、LPS1916細胞は全く障害されなかった。
LPSの濃度依存性は、この新しいアッセイ法とコロニー形成法とでほぼ同一で、これらの結果より、この方法が遺伝子導入後の細胞のスクリーニング及び評価法として利用可能であることが示唆された。さらに、現在、遺伝子導入を検討しているRAW264.7細胞においても、新しいアッセイ法でJA-4細胞と同様のLPS感受性を示すことが明らかにされたことから、今後は、JA-4及びLPS1916細胞由来の遺伝子をRAW264.7細胞に導入し、このアッセイ法を用いて耐性遺伝子のクローニングを進める方向で検討している。

Research Products

• [Publications] Inoue,S., Itagaki,S.-I. and Ammano,F.: "Intacellular killing of Listeria monocytogenes in the J774.1 macrophage-like cell line and the lipopolysaccharide (LPS)-resistant mutant LPS1916 cell line defective in the generation of reactive oxygen intermediates after LPS treatment." Infection and Immunity. 63. 1876-1886 (1995)
• [Publications] Amano,F. and Noda,T.: "Improved detection of nitric oxide radical (NO・) production in an activated macrophage culture with a radical scavenger, carboxy PTIO, and Griess reagent." FEBS Letters. 368. 425-428 (1995)
• [Publications] Amano,F.: "Inhibition of zymosan-induced macrophage functions by diisopropyl-fluorophosphate (DFP) in a macrophage-like cell, line, RAW264.7 cells." in "Proteases involved in cancer", Suzuki,M. and Hiwasa,T. eds. Monduzzi Editore, Bologna, 193 (1995)
• [Publications] 天野富美夫: "マクロファージによる潜伏感染細菌排除機構" 「LIP」 (倉田毅、天野富美夫 編) 菜根出版、東京, 213 (1995)