光ピンセットを用いて神経細胞の膜蛋白分子を捕捉する研究

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06808070
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 辰巳 仁史 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (20171720)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 片山 芳文 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (20014144)
• Keywords: 微分干渉顕微鏡 / ビデオ画像処理 / ナノメートル計測 / 光ピンセット / レーザー光 / 光学技術 / 神経生理学 / 金コロイド粒子

Research Abstract

1)脳の神経回路が構築させる発生時期の神経細胞や同時期の脳から取り出された培養神経細胞の神経突起の先端には成長円錐が形成されることを確認した。神経成長円錐は細胞運動性が高く、神経突起の伸張に必要な認識物質の識別を行い突起の伸長方向を決定し標的細胞に出会うとシナプスに変化する。この神経成長円錐からシナプスへの機能的形態的変化の機構の解明は神経科学のおける重要な研究課題である。本研究により以下のような結果を得た。
2)この神経成長円錐の刺激反応の生理学的機能とダイナミックな形態的変化を結び付け総合的にシナプス形成のメカニズムを研究解明するためビデオ強化型高倍率微分干渉顕微鏡法、光ピンセット法、パッチクランプ膜電流測定法が同時にできるマルチ計測顕微鏡法を開発した。これら3つの技術はすでに個々独立して使用されているものであるが、これらを集約・組織化して、培養神経細胞に操作を加えながらその構造の変化や機能の発現を観察・解析できるようにした。
3)このマルチ計測顕微鏡を用いて以下のような実験と研究を行った。培養大脳基底核神経細胞の神経成長円錐部に、アセチルコリンのレセプターを持っていることが知られている上頚神経節の神経細胞を光ピンセットにより移動した。ビデオ強化型微分干渉顕微鏡の観察と同時に上頚神経節の神経細胞からホールセルパッチクランプ膜電流測定をおこなった。そこで大脳基底核神経細胞を電気刺激し、シナプス形成過程にある神経成長円錐部からアセチルコリンの放出のあることを記録分析した。また両細胞の接触に伴う成長円錐部の形態変化をビデオ強化型微分干渉顕微鏡で記録解析した。この実験から、シナプスを形成するまえの神経成長円錐部から神経興奮に伴ってアセチルコリンの放出が見られ、神経連絡が行われる前から神経成長円錐は神経興奮による伝達物質の放出の機能を持つことや神経興奮に伴って神経成長円錐がその形態を変化させることが明らかになった。
4)金コロイドを含む液で細胞を潅流すると、神経成長円錐に金コロイド粒子が不着している様子をビデオ強化型微分干渉顕微鏡で観察できた。この顕微鏡システムに光ピンセットを組み込みこの金コロイド粒子に光を集光すると、金コロイド粒子を捕捉し移動できることが確認できた。金コロイド粒子をNCAM(神経接着因子)で標識し、細胞を潅流した。すると細胞の膜のNCAM分子を金コロイド粒子により標識し可視化することができた。このNCAM分子の運動の分析と光ピンセットによる分子運動に加わる力の分析を進めているところである。

Research Products

• [Publications] Tatsumi,H and Y.Katayama: "Brief increases in inttacellular Ca^<2+> activate K^+ current and non-selective cation current in rat nucleus basalis neurons." Neuroscience. 58. 553-561 (1994)
• [Publications] Tatsumi,H and Y.Katayama: "Calcium homeostasis in the presence of fura-2 in neurons dissociated from rat nucleus basalis:theoretical and experimental analysis of chelating action of fura-2." Journal of Neuroscience Methods. 53. 209-215 (1994)
• [Publications] 辰巳仁史,片山芳文: "光と細胞膜イオンチャンネルとの相互作用:近接場現象の新しい応用の可能性" 近接場光学研究グループ第二回研究討論会予稿集. 75-80 (1994)
• [Publications] Atsuko,Ono.,H.Tatsumi,K.Yamamoto and Y.Katayama: "Human Blymphocytes respond to Epstein-Barr viras with an increase in intracellular Ca^<2+> concentration" The Bulletin of Tokyo Medical and Dental University. (in press).
• [Publications] Tatsumi,H and Y.Katayama: "Analysis of Ca^<2+> homeostasis in newons dissociated from rat nucleus basalis" Neuroscience Research. (accepted).
• [Publications] 辰巳仁史(分担): "脳・神経の機能解析マニュアル「光ピンセット」" 羊土社(印刷中),