In vitro虚血-再灌流傷害モデルにおける内皮細胞の細胞基質間接触破壊の研究

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06836021
• Research Institution: NATIONAL CARDIOVASCULAR CENTER RESEARCH INSTITUTE
• Principal Investigator: 増田 道隆 国立循環器病センター研究所, 循環器形態部, 室長 (00190364)
• Keywords: 血管内皮細胞 / 虚血-再灌流傷害 / 細胞基質間接着 / Focal adhesion / チロシンリン酸化 / PECAM-1

Research Abstract

細胞と細胞外基質の結合点である接着斑(focal adhesion)は一般に極めて安定な構造である。しかし、培養内皮細胞を虚血的環境に曝した後、生理的な強さの流れずり応力(10-20dyn/cm^2)を負荷すると細胞が基質面から剥離する。これは再灌流時に内皮層の離脱・破壊が起きる可能性を示すものであり、no reflow現象や浮腫などの成因を考える上で興味深い事実である。本実験では流れ負荷細胞培養装置の灌流を停止し、極微量の培養液中に細胞を密封することにより虚血的環境を作っている。従って具体的にどのような細胞傷害性要因が灌流装置内に生じているのかを明らかにすることが必要である。
1.灌流停止により生ずる細胞傷害性要因のうち何が接着傷害を引き起こし得るのかについて検討した。特殊な灌流装置を製作し、灌流停止中の培養液と細胞の変化を検討した。培養液の乳酸量増加速度が4倍上昇し、濃度も15〜20mM程度に達することや、細胞内pHが6.7に低下することがわかった。しかし、培養液の溶存酸素濃度は110mmHg程度であり、著しい低下はみられなかった。個別傷害要因の探索実験では、酸化的ストレスやATP枯渇、細胞内pHのアルカリ化は、単独あるいは組み合わせても接着傷害の要因とはならず、細胞内pHを強制的に酸性化し通常培地に戻すことで(pHショック)、流れ負荷装置で観察されたものと同様の時間経過で接着破壊が引き起こされた。これらの結果はpHショックが接着傷害要因の主因であることを示すものである。
2.pHショックによりCa^<2+>の大量流入が引き起こされるが、Ca^<2+>の強制流入のみでは接着破壊は生じない。接着傷害の時間経過に一致して接着斑の安定性に関与するとされるpp125^<FAK>などのチロシンリン酸化が〓進し、genisteinなどのチロシンリン酸化酵素阻害剤がCa^<2+>流入と接着傷害を強力に防止した。従って、Ca^<2+>の関与は今後の検討課題として残るものの、接着破壊のメカニズムにチロシンリン酸化が関わるものと結論した。
3.チロシンリン酸化が〓進するタンパクの中で、流れ刺激や浸透圧ショックでもリン酸化の〓進が認められる膜タンパクを見いだしたので、クローニングを試みた。このものは免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着因子であるPECAM-1であり、始めてPECAM-1がチロシンリン酸化を受けることを明らかにした。

Research Products

• [Publications] 増田 道隆: "血管内皮細胞の流れに対する応答とその機構" 蛋白質 核酸 酵素. 41. 34-47 (1996)
• [Publications] N. Harada: "Fluid flow and osmotic stress induced tyrosine phosphorylation of on EC 128kDa serface gycoprotein." Biochem. Biophysc. Res. Commun.214. 69-74 (1995)
• [Publications] K. Katoh: "Focal adhesion proteins associated with apical stress fibers of human fibroblasts." Cell Motil. Cytosbeleton. 31. 177-195 (1995)
• [Publications] 増田 道隆: "培養血管内皮細胞の流れ応答性" 循環器病研究の進歩. 31. 84-94 (1995)
• [Publications] 増田 道隆: "血管内皮細胞は血液の流れにどのように応答するか" 化学と生物. 32. 386-390 (1994)
• [Publications] 藤原 敬己: "細胞骨格と接着因子" 腎と透析. 37. 451-458 (1994)
• [Publications] 増田道隆(分担執筆): "新しい光学顕微鏡(第2巻)レーザー顕微鏡の医学・生物学への応用" 学際企画, 199 (1995)
• [Publications] M. Masuda(分担執筆): "Progress in Microcirculation Research" Elsevier Science Ltd., 521 (1994)