糖脂質受容体に着目した有用魚種のプロバイオティクスとアンチバイオティクス

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06J09743
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 苣田 慎一 九州大学, 大学院農学研究院, 特別研究員(DC1) (90639791)
• Keywords: スフィンゴ糖脂質 / GM4 / 魚病

Research Abstract

1,V.harveyi(V.trachuri)のGM4結合タンパク質の単離同定、クローニングおよび、遺伝子変異株の作成
マダイ腸から単離したV.harveyiから二つの方法でGM4(NeuAcα2,3Gal-Cer)結合タンパク質候補を単離した。一方のN末端アミノ酸配列(10アミノ酸残基)はV.parahaemolyticus RIMD2210633のlateral flagellin LafA(E value=0.78)と100%一致した。
2,海洋生物、海水から、有用細菌(乳酸菌など)選択培地により単離し、GM4結合乳酸菌の選別博多湾より、GM4に結合する乳酸菌L.plantarumを2株単離した。
3,V.haraveyiの糖脂質チップを用いたoverlay assay
蛍光標識したV.harveyiはGM4、GT1b、GQ1bに結合した。これらは全て糖鎖に「NeuAcα2,3Gal」の構造を持つ。
4,魚病菌の糖脂質受容体GM4の合成酵素遺伝子のクローニング及び組織での発現
本実験は、申請書年次計画に記載していなかったが、以下の必要性のため新たに行った。魚細胞を用いた感染実験を行う際に、人為的にGM4発現株を作成したい。実験開始時点でGM4合成酵素のクローニングが行われた例はなかったが、本研究室ではゼブラフィッシュからGM3合成酵素(A)のクローニングを終了していた。Aのアミノ酸配列をもとに分子系統樹を作成し、GM4合成酵素候補(B)を選別した。Bをクローニング後、BをCHOP細胞で過剰発現し、細胞破砕液を酵素液とした。アクセプター基質としてGalCerを用いたところ、BはGM4を合成した。