インスリン分泌における膵β細胞のブドウ糖認識機構に関する研究-ブドウ糖認識機構の障害と糖尿病発症の関連について-

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07044256
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 清野 裕 京都大学, 医学研究科, 教授 (40030986)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): NEWGARD Chri テキサス大学, 医学部, 准教授 ; JOHNSON John テキサス大学, 医学部, 准教授 ; FUJIMOTO Wil ワシントン大学, 医学部, 教授 ; 石田 均 京都大学, 医学研究科, 助手 (80212893) ; 津田 謹輔 京都大学, 総合人間学部, 教授 (10180001)
• Keywords: 糖輸送担体 / 電位依存性カルシウム・チャネル / 遺伝子 / 変異 / 転写調節 / 糖尿病 / 膵β細胞

Research Abstract

糖代謝に関連した遺伝子の発現を検討するための指標として、まず各遺伝子の転写調節の機序を明らかにすることとした。GLUT1遺伝子については、既に我々が転写調節領域の塩基配列および転写開始部位を明らかにしており、新たに、転写調節領域のdeletion mutantを作製してルシフェラーゼ発現プラスミドに組み込み、HepG2細胞に導入してtransient expressionの系で転写活性を測定した。deletion analysisの結果、主として転写開始点の上流‐317から下流+181の範囲に転写調節に重要な部分が存在することが推定されたため、この範囲のDNA断片をプローブとしてgel mobility shift assayとDNase I footprint法を施行した。GLUT1遺伝子の転写調節領域には複数の核蛋白結合部位が認められ、そのうちの4ヶ所はTRE(TPA Response Element)様の配列であった。さらに、これらの4ヶ所のTRE様配列はそれぞれ核蛋白に対する結合特性が異なっており、site‐directed mutagenesisに変異を導入することにより、一部では転写活性の低下が、また他のTRE様配列の変異では転写活性が亢進することが明らかとなった。GLUT2遺伝子についても同様にdeletion mutantを作製し、膵β細胞株であるHIT‐T15細胞に導入してtransient expressionの系で転写活性を検討したが、転写開始点より上流の配列はあまり重要でなく、転写開始点より下流の塩基配列のみで転写活性が認められた。一方、グルコースセンサーの候補遺伝子の蛋白に変異を導入し、蛋白の活性の変化を検討することを計画していたが、作製すべき変異が多岐にわたるため、まず、PCR‐SSCP法で遺伝子の変異を発見し、引続き活性の変化を検討することとした。これまでに、GLUT2遺伝子で糖尿病群と対照群で出現頻度の異なるsilent mutationが、電位依存生カルシウム・チャネル遺伝子のエクソン部分では糖尿病群でのみ認められる変異が発見され、後者については機能の変化について検討を進めている。

Research Products

• [Publications] Y. Seino et al.: "The molecular mechanisms of impaired glucose‐induced insulin secretion from pancreatic β cells in non‐insulin‐dependent diabetes mellitus: Altered functions of ATP‐sensitive K_+ channels and intracellular calcium signaling system." Current Tredns in Exp Endocrinol. 2. 131-138 (1995)
• [Publications] Y.Ihara et al.: "Molecular diversity and functional characterization of voltage Dependent dependent calcium channels (CACN4) Expressed in Pancreatic β‐cells." Mol Endocrinol. 9(1). 121-130 (1995)
• [Publications] N. Inagaki et al.: "Cloning and functional characterization of a novel ATP‐sensitive potassium channel ubiquitously expressed in rat tissues, including pancreatic islets, pituitary, skeletal muscle, and heart." J Biol Chem. 270(11). 5691-5694 (1995)
• [Publications] T. Miura et al.: "Effect of polygonati rhizoma on blood glucose and facilitative glucose transporter isoform 2 (GLUT2) mRNA expression in Wistar fatty rats." Biol Pharm Bull. 18(4). 624-625 (1995)
• [Publications] Y. Okamoto et al.: "Hyperresponse in calcium‐induced insulin release from electrically permeabilized pancreatic islets of diabetic GK rats and its defective augmentation by glucose." Diabetologia. 38. 772-778 (1995)
• [Publications] Y. Yamada et al.: "The structures of the human calcium channel α1 subunit (CACNL1A2) and β subunit (CACNLB3) genes." Genomics. 27. 312-319 (1995)
• [Publications] S. Seino et al.: "Diabetes 1994" Excepta Medica, Amsterdam., 6 (1995)
• [Publications] S. Kato et al.: "Diabetes 1994" Excepta Medica, Amsterdam, 3 (1995)