高品質結晶によるアミノ基転移酵素の反応中間体の高分解能構造解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07224211
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 広津 建 大阪市立大学, 理学部, 教授 (10047269)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡本 明弘 大阪医科大学, 医学部, 助手 (40243159)
• Keywords: アミノ基転位酵素 / ラウエ法 / 反応機構 / コンホメーション変化 / 好熱菌 / 結晶化

Research Abstract

アスパラギン酸アモノ基転移酵素(AspAT)はサブユニット2個からなる2量体で、サブユニットは大小2つのドメインからなる。基質(阻害剤)結合時に小ドメインが大きく動き活性部位を閉じる。これをopen⇔closed変化と呼び、触媒反応にとって極めて重要である。大腸菌AspATは結晶状態を維持したままこの変化を起こすので、ラウエ法による時間分割構造解析の可能性がある。これまでどのような結晶がラウエ法によるデータ収集に適しているかを、野生型AspATと変異型AspATについて調べた。これまでの結晶は、結晶毎にラウエ回折斑点の形状が異なり、データとして使用できる結晶はまれであった。この問題を克服するために、できるだけ低濃度の硫安から高品質結晶を得る条件をhanging drop法により検索した。まず、平衡状態(reservoir溶液は40%飽和硫安)に到達したら、種結晶を入れる。入れるとすぐに、多数の結晶が析出する。次に、reservoir溶液として30%飽和硫安を用い、平衡に達したら40%飽和硫安から得られた結晶を種結晶として入れる。これでは種結晶は溶けてしまうので、種結晶を入れると同時に、reservoir溶液を35%飽和硫安に置換すると、少し溶けた種結晶が成長する。この方法は再現性があり、一個の結晶が得られ、かつ高品質でラウエ実験に適していた。ラウエパターンはきれいであるが、指数付けにまだ問題がある。また好熱菌AspATの結晶化を行い、重原子同型置換により、初期位相の決定に成功し、現在、N末端の30残基を残して3次構造を決めることができた。好熱菌は安定で大腸菌AspATよりラウエ実験に適していると考えられ、この酵素についても動的解析を試みる。

Research Products

• [Publications] Chiaki Setoyama et al.: "Crystallization of Expressed Kidney D-Amino Acid Oxidase and Preliminary X-Ray Crystallographic Characterization" J.Biochem.119(in press). (1996)
• [Publications] Akihiro Okamoto: "An Aspartate Aminotransferase from an Extremely Thermophilic Bacterium,Thermus thermophilus HB8" J.Biochem.119. 135-144 (1996)