新規がん抑制遺伝子DANおよびその産物の機能の解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07272247
• Research Institution: Chiba Cancer Center (Research Institute)
• Principal Investigator: 崎山 樹 千葉県がんセンター, 研究局, 局長 (30260243)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾崎 俊文 千葉県がんセンター, 研究局・生化学研究部, 研究員 (40260252)
• Keywords: DAN / ゲノム遺伝子 / Two-hybrid法

Research Abstract

1.ヒトDANゲノム遺伝子のクローニングと構造解析
P1ライブラリーのスクリーニングを行うことにより、全長約15KbのヒトDNAゲノム遺伝子をクローニングした。DAN遺伝子は4個のエキソンから構成されるており、現在第1イントロン(約10Kb)の一部を除き塩基配列を決定している。第1イントロン内にはマイクロサテライトマーカーとして知られるCAリピートが存在してた。
2.Two-hybrid法によるDAN結合タンパク質に対するcDNAのクローニング
酵母のtwo-hybrid法により、DANタンパク質に結合するタンパク質の検索を行った。ラット肺由来のcDNAライブラリーに対してスクリーニングを行った結果、複数の陽性クローンを得ることができた。
3.マウスDANcDNAのクローニング
NIH3T3細胞のcDNAライブラリーより、マウスのDANcDNAをクローニングした。NIH3T3細胞を様々な発がん遺伝子で悪性転換した細胞でも、ラットの系と同じくDANの発現は抑制されていることが判かった。
4.分泌されたDANタンパク質の生物活性の検討
細胞外へ分泌されたDANが細胞増殖に及ぼす影響を検討した。DAN高産生クローンから培地中に分泌されるDANを部分精製し、これをRSV-3Y1細胞に添加し(100ng/ml)、Thymidineの取り込みを測定した結果、DAN添加によりDNA合成は約40%抑制されることが判明した。
5.DANタンパク質のNi^<2+>結合能
DANタンパク質のC末端側にある(HX)nリピートに、Ni^<2+>,Zn^<2+>等の金属イオンと結合することが明らかとなった。さらに、3Y1細胞の抽出液中にあるDANを用いた場合もNi^<2+>ーレンジに結合するDANタンパク質をWestern法により確認することができた。

Research Products

• [Publications] Whitr, P. S et al.: "A region of consistent deletion in neuroblastoma maps within lp36.2-.3." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92. 5520-5524 (1995)
• [Publications] Kondoh, K. et al.: "DAN gene products has an affinity with Ni^<2+>." Biochem. Biophys. Res. Comm.216. 209-215 (1995)
• [Publications] Ozaki et al.: "Molecular cloning and characterization of a novel gene homologous to cdc37 gene" DNA Cell Biol.14. 1017-1023 (1995)
• [Publications] Ozaki, T. et al.: "Sequence-specific DNA binding activity of rat cdc37 gene product" FEBS Letters. 375. 155-158 (1995)
• [Publications] Ozaki, T. et al.: "Cloning of mouse DAN cDNA and its down-regulation in transformed cells." Jpn. J. Cancer Res.87. 58-61 (1996)