1995 Fiscal Year Annual Research Report

NMRとX線小角散乱によるクロコウジカビ酸性プロテアーゼAの折れたたみ機構の解析

Research Project

Project/Area Number	07280203
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	田之倉優東京大学, 農学部, 教授 (60136786)
Keywords	酸性プロテアーゼ / クロコウジカビ / 非ペプシン型酸性プロテアーゼ / NMR / 核磁気共鳴法 / X線小角散乱 / Kratky plot
Research Abstract	クロコウジカビA.nigerが分泌する酸性プロテアーゼAは、基質特異性、阻害剤に対する反応性等の性質が、従来のペプシン型酵素とは著しく異なる。intact酵素の分子量は22,000で、軽鎖(39残基)と重鎖(173残基)の2本鎖が非共有結合的に結合している。プロテアーゼAは酸性では安定であるが、中性以上のpHで不可逆的に変性し軽鎖と重鎖が解離する。本研究では、プロテアーゼAの水溶液中の構造、中性変性中間状態ならびに変性過程の解析を行ない、プロテアーゼAの折れたたみ機構を明らかにするためにNMRスペクトルとX線小角散乱の測定を行った。本酵素のpH変性について種々の方法を用いて、詳細な解析を行った結果、変性の中点pHはNMRで6.6,CDで6.1、HPLCで6.0とNMRがCDやHPLCに比べて約0.4高かった。NMRとCDによる変性中点pHの差については、変性中間体の存在が現在唯一の整合的な解釈であるが、その構造的特徴も側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れている、というモルテングロビュールとは逆の性状を有している。動的構造を解析するために^<13>C,^<15>Nラベル蛋白質を調製し、多核3次元NMRスペクトルを測定して解析を行っている。また、酸性から弱アルカリ性の種々のpHでX線小角散乱の測定を行った。その結果Kratky plotから、(1)pH4.5ではfolded structure、pH6.75や7.0ではunfolded stateである、(2)pH6.2では完全なfolded stateでもunfolded stateでもない中間的な状態である、ことが分かった。pH6.2のKratky plotは、モルテングロビュール状態の特徴と似てはいるが、本蛋白質の場合この特徴は、側鎖の3次構造が天然状態に保たれたまま主鎖の2次構造は壊れているために生じたと考えられる。

Research Products

(7 results)

All Other

All Publications (7 results)

[Publications] Suzuki,R.: "Relationship between thermodynamic stability and molecular structure of Lys25-ribonuclease T_1." Bioimages. 3. 65-69 (1995)
[Publications] Murphy,M.E.P.: "Structure of Alcaligenes faecalis nitrite reductase and a copper site mutant,M150E,that contains zinc." Biochemistry. 34. 12107-12117 (1995)
[Publications] Hatano,K.: "Primary structure,sequence-specific ^1H NMR assignments and secondary structure in solution of bromelain inhibitor VI from pineapple stem." Eur.J.Biochem.232. 335-343 (1995)
[Publications] Kojima,M.: "Effects of replacement of Lys25 with Gln on the conformation of RNase T_1:Sequence-specific ^1H NMR assignments of Gln25 RNase T_1 by 2D NMR." J.Biochem.118. 710-716 (1995)
[Publications] Fukada,H.: "Differential scanning calorimetric studies of the thermal unfolding of acid proteinase A from Aspergillus niger at various pHs." Thermochim.Acta. 267. 373-378 (1995)
[Publications] Sasaki,H.: "Aspartic Proteinases:Structure,Function,Biology,and Biomedical Implications(Takahashi,K.,ed.)" Plenum, 5 (1995)
[Publications] Kojima,M.: "Aspartic Proteinases:Structure,Function,Biology,and Biomedical Implications(Takahashi,K.,ed.)" Plenum, 5 (1995)

1995 Fiscal Year Annual Research Report

NMRとX線小角散乱によるクロコウジカビ酸性プロテアーゼAの折れたたみ機構の解析

Principal Investigator

田之倉 優 東京大学, 農学部, 教授 (60136786)

Research Products

[Publications] Suzuki,R.: "Relationship between thermodynamic stability and molecular structure of Lys25-ribonuclease T_1." Bioimages. 3. 65-69 (1995)

[Publications] Murphy,M.E.P.: "Structure of Alcaligenes faecalis nitrite reductase and a copper site mutant,M150E,that contains zinc." Biochemistry. 34. 12107-12117 (1995)

[Publications] Hatano,K.: "Primary structure,sequence-specific ^1H NMR assignments and secondary structure in solution of bromelain inhibitor VI from pineapple stem." Eur.J.Biochem.232. 335-343 (1995)

[Publications] Kojima,M.: "Effects of replacement of Lys25 with Gln on the conformation of RNase T_1:Sequence-specific ^1H NMR assignments of Gln25 RNase T_1 by 2D NMR." J.Biochem.118. 710-716 (1995)

[Publications] Fukada,H.: "Differential scanning calorimetric studies of the thermal unfolding of acid proteinase A from Aspergillus niger at various pHs." Thermochim.Acta. 267. 373-378 (1995)

[Publications] Sasaki,H.: "Aspartic Proteinases:Structure,Function,Biology,and Biomedical Implications(Takahashi,K.,ed.)" Plenum, 5 (1995)

[Publications] Kojima,M.: "Aspartic Proteinases:Structure,Function,Biology,and Biomedical Implications(Takahashi,K.,ed.)" Plenum, 5 (1995)

田之倉優東京大学, 農学部, 教授 (60136786)