遺伝子工学手法を組み入れた新しい人工酵素の設計と合成

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07405060
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (A)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 今西 幸男 京都大学, 工学研究科, 教授 (00025991)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 嘉浩 京都大学, 工学研究科, 助教授 (40192497) ; 木村 俊作 京都大学, 工学研究科, 助教授 (80150324)
• Keywords: タンパク質工学 / 遺伝子工学 / リゾチーム / エステラーゼ / tRNA / 人工酵素 / ポリプロリン / 非天然アミノ酸

Research Abstract

天然アミノ酸の非天然配列を遺伝子工学的に天然酵素に導入し、新しい人工酵素を合成しようとする試みと、非天然アミノ酸を部位特異的に天然酵素へ導入する試みを行った。
1. 天然酵素としてリゾチームを選び、そのカルボキシル末端にポリプロリンを導入した。ポリプロリンの残基数を、10、20、30、40と増加させると活性は減少し、1/10程度になったが、残基数の増加に従い疎水性が増加することが、疎水性クロマトグラフにより明らかになった。また、ポリプロリン導入によりリゾチームの構造はあまり変化をうけていないことが、円偏向二色性測定によりわかった。また、ポリプロリン結合リゾチームはエタノール/水混合系でも活性を保ち、耐熱性も向上した。
2. 非天然アミノ酸でアシル化してサプレッサーtRNAを合成し、これをストップ・コドンを予め導入しておいたDNAとリボソーム系に加え、ストップコドンの部位に非天然アミノ酸を導入することを考えた。まず、非天然アミノ酸を担持したtRNAを効率よく合成するための方法を種々考案した。まず、アシル化ATPを合成し、これを基質としてRNAポリメラーゼを働かせ、末端にアシル化アデニンを有するRNAセグメントを合成した。一方で、通常のATPを用いて合成したRNAセグメントを合成し、両者をライゲーションして、アシル化tRNAを合成した。このように合成したtRNAを用いたタンパク質合成を現在検討中である。

Research Products

• [Publications] 今西幸男: "グリコース濃度に応じてインシュリンを放出するタンパク質デバイスの設計と合成" 日本化学繊維研究所講演集. 52. 25-33 (1995)
• [Publications] 今西幸男: "Glucose-sensitive insulin-releasing moleinlar systems" Pure Appl. Chem.67. 2015-2021 (1995)
• [Publications] 今西幸男: "Polymeric Materials Encyclopedia" CRC Press (Boca Raton, USA), 9600 (1996)