遺伝子工学手法を組み入れた新しい人工酵素の設計と合成

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07405060
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 木村 俊作 京都大学, 工学研究科, 助教授 (80150324)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 嘉浩 京都大学, 工学研究科, 助教授 (40192497) ; 今西 幸男 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 教授 (00025991)
• Keywords: タンパク質工学 / 遺伝子工学 / リゾチーム / エステラーゼ / tRNA / 人工酵素 / ポリプロリン / 非天然アミノ酸

Research Abstract

非天然アミノ酸の非天然配列を遺伝子工学的に天然酵素に導入し、新しい人工酵素を合成しようとする試みと、非天然アミノ酸を部位特異的に天然酵素に導入する試みを行った。
1.天然酵素としてエステラーゼを選び、そのカウボキシル末端にポリプロリンを導入した。ポリプロリンの残基数を、10、20、30と増加させると疎水性が増加することが、疎水性カラムクロマトグラフで明らかになった。また、残基数の増加により、低級アルカンエステルの加水分解活性は減少したものの、高級アルカンエステルの加水分解活性は増加した。これは、高級アルカンエステルは水溶性が減少し、疎水性のエステラーゼが接近しやすくなるためと考えられた。
2.非天然アミノ酸でアシル化してサプレッサーtRNAを合成し、これをストップ・コドンを予め導入しておいたテンプレートDNAとリボソーム系に加え、ストップコドンの部位に非天然アミノ酸を導入することを試みた。ベンジルグルタメートで2位をアシル化したアデノシン3リン酸を合成し、DNAテンプレートから転写反応によりミスアシル化tRNAを合成した。合成したミスアシル化tRNAをチトクロームP-450のトレオニンに相当するコドンをストップコドンに変えたDNAテンプレートとリボソーム系の混合溶液に添加し、トレオニンをベンジルグルタメートで置換したチトクロームを合成した。

Research Products

• [Publications] Yoshihiro Ito: "Hydrophobilization of lysozyme by genetic combination with polyproline at the corboxyl terminal" Chemistry Letters. 1. 65-66 (1997)
• [Publications] Yoshihiro Ito: "Nen-radioisotope assay to examine adaptability of nonnatural amino acids to the active center at ribosomal A site" Journal of Bioaotine and Compatible Polymers. 12(印刷中). (1997)
• [Publications] Yoshihiro Ito: "Polymeric Materials Encyclo pedia" CRC Press, 5000 (1996)