シャペロニンGroELの標的タンパク質認識の分子機構

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07408017
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (A)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 桑島 邦博 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助教授 (70091444)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊倉 貞吉 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (50251393)
• Keywords: 分子シャペロン / シャペロニン / GroEL / 折れたたみ機構 / 球状タンパク質 / α-ラクトアルブミン / スタフィロマッカルヌクレアーゼ

Research Abstract

代表的な分子シャペロンである大腸菌GroELの標的タンパク質認識の分子機構を明らかとする目的で、ウシα-ラクトアルブミン(αLA)のMG状態からの巻き戻り反応に及ぼすGroELの影響をストップトフロー蛍光スペクトルにより調べた。GroELが共存するとアポαLAの巻き戻り速度が低下し、αLAのMG状態がGroELにより認識されることが明らかとなった。各タンパク質の濃度を巻き戻り速度低下率よりMG状態にあるαLAとGroELとの結合定数が求められた(pH7、イオン強度0.1Mで5×10^5M-1)。この結合は、1μM程度の濃度下でなされる分子篩いクロマトグラフィーでは観測することができなかったが、巻き戻りの速度過程に及ぼすGroELの影響を解析することにより定量的に評価できた。結合が室温ではエントロピー駆動であること、結合に伴って熱容量が大きく減少することより、この結合は疎水性相互作用によりもたらされると考えられる。GroELは強い酸性タンパク質であり、同じ酸性タンパク質であるαLAとの結合はイオン強度の増大とともに強くなることも観測された。従って、GroELの標的タンパク質認識には、静電相互作用も重要である。上の事実より、GroELは、塩基性タンパク質の中間体に対しては特に強い親和性を示すことが期待される。そこで、スタフィロコッカルヌクレアーゼのP117G+P47A変異体の巻き戻り速度に対するGroELの影響をストップトフロー蛍光スペクトルにより調べた。数マイクロモル過剰のGroELの存在下で、ヌクレアーゼの巻き戻りが停止し、GroELからの解離と巻き戻りの進行には過剰のATPが必要であることが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Katsumata,Kumiko: "Effect of GroEL on the refolding kinetics of alpha-lactalbumin" J.Mol.Biol.(in Press). (1996)
• [Publications] Kuwajima,Kunihiro: "The molten globule state of alpha-lactalbumin" FASEB J.10. 102-109 (1996)
• [Publications] Uchiyama,Hidefumin: "Effect of amino acid substitution in the hydrophobic core of alpha-lactalbumin on the stability of the molten globule state" Protein Eng.(in Press). (1995)
• [Publications] Kalnin,Nikolay N.: "Kinetic folding and unfolding of staphylococcal nuclease and its six mutants studied by stopped-flow circular dichroism" Proteins:Structure,Functions and Genetics. 23. 163-176 (1995)
• [Publications] 桑島邦博: "GroELによる標的タンパク質認識の分子機構" 蛋白質核酸酵素. (印刷中). (1996)