1996 Fiscal Year Annual Research Report
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07456049
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
山田 康之 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (50026415)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西岡 孝明 京都大学, 農薬研究施設, 教授 (80026559)
橋本 隆 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (80180826)
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| Keywords | stereospecificity / crystallography / reductase / alkaloid |
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| Research Abstract |
昨年度に検討した両TR酵素の結晶化及び測定条件を最適化した。TR-IIにおいてはX線による結晶の損傷を抑えるため、結晶を液体窒素中で凍結し-160℃の冷気中で測定をおこなった。TR-Iでは分解能2.4ÅまででRmerge=4.34%、TR-IIでは2.6Åまでで6.32%の信頼性の高いデータを収集できた。TRには1次構造上の相同性が高く3次元構造が既知のタンパク質が存在しないため、回折X線波の位相は重原子置換法により計算した。まず重金属元素としてHg,Pt,Au,Sm,Ir,Pbを含む約20種の化合物や無機塩を含む溶液にそれぞれの結晶を浸漬し、試薬の濃度や時間を検討した。置換が期待された結晶は回折データを収集し、非置換体結晶との差パタ-ソン計算や差フーリエ計算によって重原子置換の有無を確認した。最終的にTR-Iでは水銀化合物であるEMTSで、TR-IIではHgCl_2またはKAu(CN)_2で置換した場合に位相計算に適した置換体結晶が得られた。これらの回折データから異常分散差を含めて位相を計算し溶媒領域の平滑化により改善した。計算された位相の正しさを表すfigure of meritの平均はTR-Iで0.81、TR-IIで0.82であった。これらの位相より計算した電子密度図は、両TRとも一部の領域を除いてアミノ酸側鎖の方向までが明確に認識できる良好なものであった。この電子密度図をもとにグラフィックプログラム上でTRタンパク質の構造モデルを作製した。電子密度の不明瞭な部分は、明瞭な部分のモデルから計算した位相を使って電子密度図を計算し直した。このようにして作製したモデルをプログラムX-PLORにより繰り返し精密化したところ、測定値との誤差を示すR値はTR-Iで20%、TR-IIで22%にまで低下した。
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