ポルフィロモナスの産生するプロテアーゼに関する分子遺伝学的研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07457071
• Research Institution: Nippon Dental University
• Principal Investigator: 吉川 昌之介 日本歯科大学, 歯学部, 教授 (80012714)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 熊谷 由美 日本歯科大学, 歯学部, 助手 (90277591) ; 倉持 利明 日本歯科大学, 歯学部, 助手 (80277590) ; 高橋 幸裕 日本歯科大学, 歯学部, 講師 (00281436) ; 古西 清司 日本歯科大学, 歯学部, 助教授 (20178289)
• Keywords: プロテアーゼ / ポルフィロモナス / 分子遺伝学 / 病原性

Research Abstract

成人歯周病原因菌のPorphyromonas gingivalisは種々のプロテアーゼを産生し、それらは主要な病原因子であると考えられている。本プロジェクトでは、プロテアーゼの蛋白化学的解析及び分子遺伝学的解析をめざしている。
1.P.gingivalisの遺伝子断片をプラスミドベクターに組み込み、複数のゲノムライブラリーを作製した。これらを使って大腸菌を形質転換し、カゼイン分解を指標としてプロテアーゼ活性をコードしている遺伝子をスクリーニングしたところ、既知のプロテアーゼ遺伝子のひとつであるtpr遺伝子がクローニングされた。都合10,000個スクリーニングしたが、今回用いた実験系で得られたプロテアーゼ遺伝子はtprのみであった。今後さらにスクリーニング方法を変えて検討を続行する予定である。
2.本菌のプロテアーゼのうちArg-gingipainの性質が最も良く理解されているが、いまだに成熟酵素の大腸菌での発現系は報告されていない。今回この点について検討した結果、適当な発現系が確立されたが、今後部位特異的変異法を用いて酵素の性質をさらに追求する予定である。
3.本菌のグリシルプロリルペプチダーゼは、生体組織のコラーゲンの分解に重要な役割を担っていると考えられている。まず本酵素の完全精製を行い、それらより蛋白の部分一次配列を複数決定した。この情報をもとにPCRを行ったところ、約15K塩基対のDNAが増幅された。この塩基配列から真核生物のジペプチジルペプチダーゼIVと同じグループの属することが示唆された。さらにPCR産物をプローブとして、本酵素遺伝子のクローニングに成功し、現在全塩基配列を決定中である。