プラスミドとファージキメラによる複製開始蛋白質の機能解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07457072
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 寺脇 良郎 信州大学, 医学部, 教授 (10014333)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田渕 晃 信州大学, 農学部, 助手 (50236725) ; 大西 真 信州大学, 医学部, 助手 (10233214) ; 林 哲也 信州大学, 医学部, 助教授 (10173014)
• Keywords: プラスミトRts1 / ファージP1 / 複製開始蛋白質 / キメラ蛋白質 / 機能的ドメイン / DNA結合能 / 複製開始能 / 複製調節

Research Abstract

プラスミドRts1の複製開始蛋白質RepA(288アミノ酸残基)の持つ2つの機能、すなわち複製開始点oriに結合してDNA複製を開始させるポジティブな働きと、開始した複製反応を制御するネガティブな働きがRepA分子上どこに局在するかを解明する目的で本研究を行った。そのため、Rts1-RepA分子と相同性が高く、しかし特異性の異なるP1ファージの複製開始蛋白質RepA(286アミノ酸残基)との間で一連のキメラ蛋白質RepALXnを作成し、機能を解析した。
研究結果
1、作成したキメラ蛋白質:RepALX_<12>(P1-RepA256/Rts1-RepA31aa),RepALX_<13>(205/82),RepALX_<15>(144/143),RepALX_<17>(112/175)。
2、P1-oriに対するin vitro結合能:LX_<12>〜_<15>が結合し、LX_<17>は結合しなかった。
3、P1-oriに対するin vivo活性化:LX_2,_3のみがP1-oriからの複製開始能を示した。
2、3は、Rts1-RepAをN末端側、P1-RepAをC末端側をするキメラ蛋白質RepAXnに対応する成績であり、Rts1-RepAのN末端側113〜129aa部位にRts1-ori結合能、これに177〜206aa部位が加わることによりRts1-oriが活性化されるとのすでに得られた知見を強く支持する。
4、Rts1-oriに対するin vitro結合能:LXnの全てが結合した。P1-RepAwtがRts1-oriに結合できることから、このことは当然の帰結と考えられる。なおRts1-RepAwtはP1-oriに結合できない。
5、RepALX_<15>について:Rts1-oriに強く結合し、且つRts1-oriを強く活性化した。興味あるキメラRepAである。
6、複製開始を制御する機能については現在実験中である。

Research Products

• [Publications] Akira Tabuchi,他: "Analysis of functional domains of Rts1 RepA by means of a series of hybrid proteins with P1 RepA" J. Bacteriology. 127. 4028-4035 (1995)
• [Publications] 季,永芳,他: "P1-Rts1ハイブリッドRepA蛋白の機能解析" 日本細菌学雑誌. 151. 198 (1996)