1995 Fiscal Year Annual Research Report
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07457232
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Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大熊 稔 京都大学, 医学研究科, 教授 (50026986)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高山 博史 京都大学, 医学研究科, 助手 (10197220)
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| Keywords | ヒト血小板 / トロンボキサンA_2受容体 / コラーゲン受容体 / アイソフォーム / GPVT / RT-PCR |
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| Research Abstract |
1.トロンボキサンA_2(TXA_2)受容体アイソフォームの分子構造に関する研究:ヒトTXA_2受容体には胎盤から単離されたもの(TXRα)と、内皮から単離されたもの(TXRβ)が存在する。ヒト血小板におけるTXA_2受容体のアイソフォームを検討するため、血小板RNAからRT-PCRを行い、第3膜貫通領域に位置するプライマーと両アイソフォームに共通の3′非翻沢領域に位置するプライマーを用いたところ、逆転写酵素依存性に2つのフラグメントが増幅された。これらのフラグメントをサブクローニングし、塩基配列を決定したところ、それらはTXRαとTXRβに対応していることが明らかとなった。さらに異なるプライマーの組合わせでいずれも予想される長さの2つのフラグメントが増幅されたことから、血小板にはTXRα、TXRβと同じ構造を有する2つのアイソフォームが存在することが明らかとなった。また血小板TXRαにミスセンス変異(Arg^<60>→Leu)を認めた症例のTXRβは正常であることが判明した。
2.コラーゲン受容体(GPVI)の分子構造に関する研究:今回ハイロードシステム(ファルマシア)の導入により、DEAE Sepharose FFを用いて血小板膜分画の迅速な分離が可能となった。DEAE Sepharose, WGA agarose 及び抗GPVIアフィニテフィーカラムにより粗精製したGPVIをSDS-PAGEで展開すると、還元条件下では再現性よく約60kDaのバンドが得られた。これをPVDF膜に転写した後、APIマッピングによって内部アミノ酸配列の分析を試みたが、量的不足のため優位なシグナルを得られなかった。したがって、現在各精製ステップでのGPVIの回収率を検討するとともに、ハイドロキシアパタイトや疎水クロマトグラフィーによるGPVIの分離の可能性に関しても検討中である。
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[Publications] T. Ishibashi: "Functional Significance of platelet memarane glycoprotein P62 (GPVI),a putative collagen receptor" International Journal of Hematology. 62. 107-115 (1995)
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[Publications] T. Hirata: "Two thromboxane A_2 receptor isofarms in human platelets:Opposite coupling to ademlyl cyclase with different Sensitivity to Arg^<60> to Leu mutatian" Journal of Ceinical Iwestigatian. (印刷中). (1996)
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[Publications] T. Iclinobe: "Cyclic AMP-inseustive actioation of C-Src and Syk protein tyrosine kinases through platelet membrane glycoprotein VI" Journal of Biolagical Chemistry. 270. 28029-28036 (1995)
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[Publications] 大熊 稔: "出血・血栓症とプロスタグランジン" 現代医療. 27. 1913-1920 (1995)
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[Publications] 平田多佳子: "トロンボキサンA_2受容体異常症の症例" 治療学. 29. 1177-1181 (1995)
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[Publications] Y. Ezumi: "Differential regulation of protein-tyrosine phosphatases by integrin LIIbβ_3 lthrough aytoskeletal reorganization and tyrosine phosphorylation in human platelets" Journal of Biological Chemistry. 270. 11927-11934 (1995)
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[Publications] 大熊 稔: "血液病学(第2版)" 三輪史朗,青木延雄,柴田昭(編), 7 (1995)
