膀胱内注入in vivo transfection実験系確立と遺伝子治療への応用

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07457373
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 守殿 貞夫 神戸大学, 医学部, 教授 (30030935)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 原 勲 神戸大学, 医学部, 助手 (10263378) ; 江藤 弘 神戸大学, 医学部, 助手 (90213553)
• Keywords: invivo DNA導入 / 膀胱内注入 / 遺伝子治療

Research Abstract

ラットに対しリン酸カルシウム法及びリポソーム法を用いてDNA膀胱内注入を行っている。ラットは雄約9週齢を用い、膀胱注入には18G留置針をガイドワイヤー下に膀胱に挿入、1〜5μg/0.1mlの濃度になるよう調整したDNAを注入する。注入後尿道をクランプまたは結紮、24〜48時間後に膀胱を摘出する。用いているDNAはpSRα-βgalで、transientな発現を免疫学的、生化学的手法により、解析している。尿中でのDNAリン酸カルシウム沈殿は、当初安定に存在しうるものと考えていたが、経時的に不安定となり、リポソーム法が安定した膀胱内注入が可能であることが判明した。リポソーム法を用いて膀胱内にDNAを注入した場合、低率ではあるが膀胱粘膜上皮にβgalの発現を認めた。βgalの発現は粘膜のもっとも表層に限られており、導入条件などを変えたとしても深層への遺伝子導入が困難であることが示唆された。逆に、表層においてのみ発現することを念頭においた治療への応用の可能性があり、注目している。遺伝子の導入効率を高めることが遺伝子治療への応用の可能性の決め手となることから、より高率にDNAを発現させるための条件設定を行っている。尿道のクランプの時間、DNAの濃度、注入量、摘出の時期などを検討しているが、膀胱に対する前処置や発現効率をより高めるためにHVJリポソーム法やカチオニックリポソーム法等でも検討を行う予定である。また同時に、副作用の検討を行っている。副作用の検討には同一条件下に2系統のラットを用意し、一方は遺伝子発現の解析を行い、他方はリンパ球浸潤、出血巣の有無、粘膜上皮の状態などを元に、副作用に確認を行っている。