超好熱菌アミノ酸トランスポーターの構造・機能協関

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07458161
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• Research Institution: Himeji Institute of Technology
• Principal Investigator: 平田 肇 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鎌田 英明 姫路工業大学, 理学部, 助手 (10233925) ; 八木澤 仁 姫路工業大学, 理学部, 助教授 (40192380)
• Keywords: 超好熱菌 / 好熱菌 / アミノ酸トランスポーター / 大量発現 / 融合タンパク質

Research Abstract

本研究は海底火山等の極限条件下で生育する超好熱菌類のアミノ酸トランスポーターについて分子生物学的解析、生化学的解析、さらに電気生理学的解析を行うことによって極限条件下での膜タンパク質の機能が構造とどのような関連があるかを明らかにすることを目的とし、さらに12回膜貫通ドメインを有するトランスポーターの構造・機能協関について分子進化論的解析を行うことにより生命の起源や生物進化に関する新たな考察を試みることを目標としている。本年度の研究実績は以下の通りである。
(1)超好熱菌Thermococcus属のKS-1株から得られた全DNAよりゲノムライブラリーを作成した。これを大腸菌RM1(アラニン・グリシン輸送欠損)株に導入し、機能発現を指標にスクリーニングを繰り返すことによってアラニントランスポーター遺伝子のクローニングの目途がついた。
(2)しかし機能発現に用いたRM1株は高頻度で復帰変異する傾向があるため、相同組み替え法を用いてより安定なアラニン・グリシン輸送欠損株を作成した。現在この株を用いてKS-1ゲノムライブラリーからアラニントランスポーター遺伝子のクローニングを試みている。
(3)好熱菌PS3のアラニントランスポーター(ACP)遺伝子とマルトース結合タンパク質(MBP)遺伝子との融合遺伝子を作成し、大腸菌TB1株内で大量発現する条件を確立し、全膜タンパク質の25%を超える量のACPタンパク質を得ることが出来た。

Research Products

• [Publications] Murai N.: "A novel insertion sequence(IS)-like element of the thermophilic bacterium PS3 promotes expression of the alanine carrier protein-encoding gene." Gene. 163. 103-107 (1995)
• [Publications] Shinomiya H.: "Complete Primary Structure and Phosphorylation Site of the 65 kDa Macrophage Protein Phosphorylated by Stimulation with Bacterial Lipopolysaccharide." J.Immunol.154. 3471-3478 (1995)
• [Publications] 平田 肇: "日本生物物理学会編集「生体膜」第3章イオンポンプ" 吉岡書店, 19 (1996)