受精・胚発生過程で卵膜の制御にあずかるプロテアーゼ

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07458193
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 片桐 千明 北海道大学, 大学院・理学研究所, 教授 (90000827)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山下 正兼 北海道大学, 大学院・理学研究所, 助教授 (30202378)
• Keywords: 孵化酵素 / 卵膜ライシン / 卵外被 / 輪卵管直部 / プロテアーゼ / 分泌顆粒 / 遺伝子発現

Research Abstract

(1)stage 22-24のツメガエル胚の頭部片からRNAを抽出し、このなかからこれまで胚の頭部表皮に発現する遺伝子として報告されていたUVS.2のcDNAとハイブリダイズする分子を選別し、そのcDNAを得た。得られた1、802塩基からなるクロン(X-HE)は、Zn結合ドメインを含むアスタシンファミリーに属するプロテアーゼとみられる514ケのアミノ酸をコードする領域をもち、またポリAテイルももっていた。種々の発生段階の胚から得たRNAとノーザン解析を行なったところ、X-HEはst.17-18には発現していることがわかった。またUVS.2をglutathione-S transferase遺伝子と融合させて得た融合蛋白質を用いてウサギを免疫し、それを利用したウエスタン解析および免疫組織化学的観察から、胚の分泌物に含まれる抗原分子は分子量50KDであり、孵化腺細胞の分泌顆粒に局在することが証明された。
(2)HCGでプライムしたヒキガエル雌の輪卵直部組織からパーコール密度勾配遠心法によりプロテアーゼを含む分泌顆粒を分離し、またヒキガエル精子を超音波処理するこにより卵膜ライシン粗分画を得た。それらをQ-SepharoseおよびSuperdex75により分画、逆相HPLCによりさらに精製して、輪卵管プロテアーゼについては66KD、卵膜ライシンンについては32KD分画を回収した。これらをリジルエンドペプチターゼ処理ののち、Edmann法によりそれぞれ約15アミノ酸残基を決定することができた。それをもとに約30塩基よりなるオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとしてこれら2種のプロテアーゼのcDNAをクローニング中である。

Research Products

• [Publications] Ohsumi,k.,Oh.Katagiri et al.: "De pendence of removal of sperm-specific proteins from Xenopus sperm nuclei on the phosphorylation state of nucleoplasmin." Develop.Growth,Differ.37. 329-336 (1995)
• [Publications] Rice,P.,Ch.Katagiri et al.: "Nucleoplasmin-mediated decondensation of Mytilus sperm chromatin." Biochemistry. 34. 7563-7568 (1995)
• [Publications] Moriya,M.,Ch.Katagiri et al.: "Immunohistochemical localization of calmodulin-dependent protein phosphatase,calcineurin,in the mouse testis." Cell Tissue Res.281. 273-281 (1995)
• [Publications] Takamune,K.,Ch.Katagiri et al.: "The occurrence of a gene-encoded variant of nuclear basic protein(SP4) in sperm of Xenopus laevis." Biochem.Biophys.Res.Commun.214. 622-626 (1995)
• [Publications] Mita,K.,Ch.Katagiri et al.: "Structure and expression of genes for sperm-specific nuclear basic protein(SP4)in Xenopus laevis." Biochim.Biophys.Acta. 1245. 430-438 (1995)
• [Publications] Tanaka,T.,& M.Yamashita: "Pre-MPF is absent in immature oocytes of fishies and amphibians except Xenopus." Develop.Growth,Differ.37. 387-393 (1995)