1996 Fiscal Year Annual Research Report
神経細胞分化成熟因子としての一酸化窒素の作用;超微量技術による解析
Project/Area Number |
07458206
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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Research Institution | Yokohama City University |
Principal Investigator |
加藤 尚彦 横浜市立大学, 医学部, 教授 (80010023)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 孝 横浜市立大学, 医学部, 講師 (90150060)
井上 順雄 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (50159985)
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Keywords | 一酸化窒素 / 一酸化窒素生成酵素 / 小脳外顆粒層 / 小脳顆粒細胞初代培養 / Micro-RT-PCR / Micro-Western blot / nNOS mRNA / nNOS |
Research Abstract |
生後8日目のSDラット小脳より単離した細胞群を,25mMKCl;5%ウシ胎児血清;5%ウマ血清を含むBME中で14日培養した.培養1,5,8,13日目に,細胞からtotal RNAを抽出し,その中に含まれるnNOSのmRNAを,昨年度開発した定量的RT-PCR法を用いて増幅定量した.anti-sense primer(5'-TCTGCAGCGGTATTCATTCTC-3')の5'-末端を^<32>Pでラベルし,sense primer(5'-TTCAACTACATCTGTAACCA-3')を用い,増幅DNA産物をagarose gelで電気泳動分離後,BAS2000を用いて放射定量をおこなった.内部標準としてマウスtotal RNAを用いて,ラットnNOS-mRNAをマウスtotal RNA相当量(1ng=1unit)で表わすと,8日目の小脳全体(0.021units/ng total RNA)と比較して,初代培養顆粒細胞では1日目0.004,5日目0.01,8日目0.013と増加したが,13日目では0.05に減少した.dish当たりでは,1日目0.12,5日目0.28,8日目0.32,13日目0.19unitsと,細胞のtotal RNA当たりの値とほぼ並行して増減した.2週間培養してもdish当たりの蛋白量は増加し,形態的にも変性を思わせる変化は見られないが,nNOSのmRNAレベルは減少し始め,細胞の"老化"を示している.昨年度開発したmicro-Western blotを用いて,培養細胞のnNOS蛋白質を定量すると,そのmRNAと同様な増減の変化を示していた.これ等の実験と並行して,昨年度からの課題のmicro-RT-PCRを工夫した.生後12日目の小脳の各層試料0.98-2.82μg乾燥重量と0.25-1.0ngの内部標準のマウスtotal RNAを100μlの抽出緩衝液に加え,通常の1/4にscale-downしたoligo-dT cellulose columnを用い居てmRNAを分離して,最終的に100μlの反応液中でPCR反応を行った.未だ定量性に問題はあるが,外顆粒層にnNOSが存在することを,このmicro-RT-PCRにより初めて証明出来た.
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Research Products
(8 results)
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[Publications] Kato T,Inoue N,Nakayama T: "Expression of nitric oxide synthase (NOS) in developing and maturing rat cerebellum." Bulletin of the Japanese Society for Neurochemistry. 35. 218-219 (1996)
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[Publications] Nagamatsu S,Nakamichi Y,Inoue N,Inoue M,Nishino H,Sawa H: "Rat C6 glioma cell growth is related to glucose trasport and metabolism." Biochem.J.319. 447-482 (1996)
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[Publications] Yamaguchi K,Nakayama T,Fujiwara T,and Akagawa K: "Enhancement of neurite-sprouting by suppression of HPC-1/syntaxin 1A activity in cultured vertebrate nerve cells." Brain Res.740. 185-192 (1996)
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[Publications] 百木忠久,中山孝,井上順雄,佐藤忍,関原久彦,加藤尚彦: "分化発達するラット小脳におけるGlucose Transporter (GLUT) 1と3の発現." 神経化学. 35. 372-373 (1996)
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[Publications] 井上順雄,曽我智子,中山孝,加藤尚彦: "培養小脳顆粒細胞の発達に伴う一酸化窒素合成酵素の発現" 神経化学. 35. 558-559 (1996)
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[Publications] 中山孝,五嶋良郎,加藤尚彦,三須良實: "ニワトリ視蓋反発因子の細胞内情報伝達機構の解析" 神経化学. 35. 594-595 (1996)
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[Publications] Kato T,Kijima M,Ohno S.: "Distribution of S-antigen and its behavior in ocular tissues of control and EAU (Experimental Autoimune Uveoretinitis) rats,in RETINAL REGENERATION" Kuluger Publications bv,Amsterdam,the Nitherland, 99-104 (1996)
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[Publications] 加藤尚彦: "NOと中枢神経(NOの基礎と臨床:室田誠逸編)" メディカルレビュー社, 186-214 (1996)