力学的ストレス場におけるハイブリッド血管壁の遺伝子発現と組織化及び臓器工学的応用

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07458241
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 松田 武久 国立循環器病センター研究所, 生体工学部, 部長 (60142189)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林崎 良英 理化学研究所, ライフサイエンス筑波研究センター・ジーンバイク室・真核生物研究室, 主任研究員 (70192705) ; 棚橋 雅美 国立循環器病センター研究所, 生体工学部, 流動研究員 ; 高市 成子 国立循環器病センター研究所, 病因部, 研究員 (00093930)

Research Abstract

(1)管状ハイブリッド血管壁組織の作成と移植(臓器工学)、(2)生体外における力学的ストレス負荷(生体工学)、(3)遺伝子発現(遺伝子工学)、(4)組織窩洞(形態学)の研究に分りるが、(1)及び(2)については論文発表している。(1)については、特別に作製した内筒と外筒を有する容器に平滑筋細胞(SMC)とコラーゲンの冷混合溶液を注入して37度に加温すると管状ゲル体が形成し、経時的にSMC及びコラーゲンが円周方向に配向した稠密組織(ハイブリッド中膜)が形成することを既に発表した。また、動物移植により人工基材を必要としない血管として作動することを予備的に検討し、発表している。(2)の生体力学的ストレス負荷に対しては、一軸伸縮及び三次元拍動ストレスを連続的に振幅及び頻度を可変できる装置を既に発表した。
上記の成果と技術に立脚して、本年度は(3)及び(4)に焦点をおいて研究し、最終目標として、力学的ストレスと遺伝子レベル、細胞レベル、マトリックスレベルの相関をしらべる。本年度は、(3)については、SMC分化誘導分子を探索した。具体的には、1.トータルRNAとDNAの抽出と定量、2.SMCの分化誘導ステージの同定、3.サブトランクション・クローニングの開始、4.後述するRLGS法によるゲノムDNAのスキャンニングを行なった。まず、Iogen法によりRNA、DNAを抽出・定量し、その際、解糖系酵素のmRNAであるG3PDHのPCRをhouse-keeping geneとしてcDNA合成評価、細胞でのmRNA発現量のマーカーにできるかどうか検討した。2.については分化誘導のかかっているステージを推定し、サブトラクション法で分化誘導因子をクローニングするのに用いるステージを模索した。既知のSMCのmRNAとしてカルボニン、ミオシン重鎖のアイソフォーム(SM1、SM2、SMemb)、α-アクチンをまず検討し、ついでdifferential displayにて未知mRNAを検出・クローニングしつつある。
(4)については、1.及び2.で作製した配向SMC/コラーゲン層よりなる柔軟性且つ稠密な組織の内腔に内皮細胞を播種し、追加培養後に血管壁細胞を採取した同じ犬の頸動脈に移植した。光顕によるコラーゲン(マッソン・トリクロム染色)、エラスチン(オルセイン染色)に加えて免疫電顕によってプメテオグリカンの種類(ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸)を同定し、その分布、及び定性的な局在化をしらべた。

Research Products

• [Publications] 松田武久: "内皮細胞機能調節因子としてのSubstrate" 細胞. 27. 49-53 (1995)
• [Publications] 神田圭一: "新しい小口径人工血管:高密度・高配向コラーゲン管状組織体" 人工臓器. 24. 185-189 (1995)
• [Publications] 平井二郎: "生体材料のみからなるハイブリッド血管壁組織体の静脈系人工血管への応用-自家移植モデルにおける検討" 人工臓器. 24. 156-161 (1995)
• [Publications] 石橋和幸: "三層構造よりなる階層型ハイブリッド人工血管の開発:細胞の動的挙動および細胞外マトリックスの再構築" 人工臓器. 24. 150-155 (1995)
• [Publications] 松田武久: "血管壁再構築と分子細胞生物学" 日本ME学会 BME. 9. 44-55 (1995)