新しい低温活性酵素の探索とその応用

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07459010
• Research Institution: Japan Advanced Institute of Science and Technology, Hokuriku
• Principal Investigator: 民谷 栄一 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 教授 (60179893)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 阪口 利文 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助手 (10272999) ; 村上 裕二 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助手 (70272995) ; 横山 憲二 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助教授 (80242121)
• Keywords: 酸化還元酵素 / 低温微生物 / 電子メディエーター / グルタミン酸デヒドロゲナーゼ / バイオセンサー

Research Abstract

低温細菌の有する低温活性酵素は、最適温度域がより低温側に移行しており、活性化エネルギーも小さく、その機能や構造に興味が持たれている。しかしながら、低温活性酵素の研究は十分に行なわれておらず、特に、酸化還元酵素についての報告は殆どなく、低温活性の構造と機能の相関については明らかになっていない。そこで本研究では、新たに低温活性酸化還元酵素を捜索した結果、新規のアクセプター型のL-グルタミン酸デヒドロゲナーゼが得られたため、バイオセンサーへの応用をめざした基礎特性について検討した。
寒冷生物であるサケ・カニの内臓から肉汁寒天培地・10℃で低温細菌を単離した。この低温細菌の中で、最もL-グルタミン酸酸化活性の高いL101菌株を選択した。この菌株は、15℃で最適増殖を示す低温殺菌であり、グラム陰性・桿菌・極鞭毛を持ち、シトクロムcオキシダーゼ・カタラーゼ・菌体外プロテアーゼなどを持ちAeromonas属に属する細菌であることがわかった。L101菌株は、陰イオン交換クロマトグラフィー(DEAE-Sepharose,pH7.0)にて分離される2種類のアイソゾイムが存在した。2つのアオソザイムのうち、陰イオン交換クロマトグラフィーから低塩濃度で溶出される酵素をさらに、硫安塩析・ゲル濾過クロマトグライ-・陰イオン交換クロマトグラフィー(Q-Sepharose)・疎水性相互作用クロマトグラフィーなどを用いて精製を行った。精製した酵素は、NADやNADPや酵素と反応せず、酸化還元色素であるニトロブルーテトラゾリウムやシトクロムcを電子受容体とする新規のL-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GLDH)であった。また、その温度特性は常温酵素である牛肝臓由来のNAD依存性のGIDHと比較して、最適温度域が低温側にあり、5℃においても最大活性(50℃)の40%の活性を残存しており、活性化エネルギーもほぼ半分の値を示した。さらに、フェロセン誘導体を電子メディエータとして、サイクリックボルタンメトリーにより酵素のキャタリティック電流も確認できた。

Research Products

• [Publications] Y.Morita et al.: "Cold-active Enzymes from Cold-adapted Bacteria" J.Amer. Oil Chenistry Soc. (in press). (1997)
• [Publications] 民谷栄一: "低温活性酵素の捜索とその分析への応用" 日本学術振興会第116委員会分科会. 57-59 (1996)
• [Publications] E.Tcuni/a: "Biosevsors 96" Elesevier Advanced Technolory, 290 (1996)