1997 Fiscal Year Annual Research Report
単一細胞からのATP放出測定法の開発とその応用に関する研究
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07556118
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| Research Institution | HOKKAIDO UNlVERSITY |
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Principal Investigator |
中里 幸和 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (60001525)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
遠藤 士郎 日本分光(株), 第一技術部, 係長
加藤 憲夫 農林水産省, 家畜衛生試験試験場・総合診断研究部, 上席研究官
伊藤 茂男 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (40109509)
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| Keywords | ATP分泌 / カテコールアミン分泌 / 分離副腎髄質細胞 / 蛍発光酵素 / 電気化学検出器 / カーボン電極 / オン・ライン測定 / ホールセル膜電位固定法 |
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| Research Abstract |
(1)培養ブタ副腎髄質細胞とモルモット副腎髄質細胞はアセチルコリンのニコチン受容体を有し、このチャネルの活性化は細胞内Na^+とCa^<2+>濃度の増加を起こし、カテコールアミン放出を増加させた。モルモット副腎髄質細胞はN、L、P/Q及びR型Ca^<2+>チャネルを有しているが、培養ブタ副腎髄質細胞ではN、L及びP/Q型Ca^<2+>チャネルが存在し、R型は存在しなかった。ブタ副腎髄質細胞では、高濃度K^+による分泌反応にはN及びL型Ca^<2+>チャネルが重要な役割を果たしていた。G蛋白質の活性化はN型Ca^<2+>チャネルを抑制した。(2)ATPフォトメータの光電子増培管の前面で発光酵素ルシフェラーゼ、ルシフェリンとATP溶液を流入混和し、ATP発光を連続的に記録した。ATPの検出限界は1-2nMであった。ブタ培養副腎髄質細胞をカバーグラスの上で培養し、培養細胞の表面灌流を行なった。灌流流出液を2分し、ATPフォトメーターと電気化学検出器によりATPとカテコールアミンを連続的に測定した。アセチルコリン、60mMKCl及び5mMBaCl_2を投与するとATPとカテコールアミン放出を起こした。いずれの刺激でも、ATPはカテコールアミンと同じ時間経過で放出され、カテコールアミン/ATPのモル比は7-12であった。(3)灌流流出液のATP、ADPとAMPはほぼ同量であり、流出液中のカテコールアミン/アデニンヌクレオチドのモル比は4-5であった。この値は分泌顆粒内のカテコールアミンとATPの存在比と類似していた。(4)単一副腎髄質細胞からのカテコールアミンの量子的放出をカーボン電極を用いて測定した。アセチルコリンは濃度依存性にカーボン電極表面近くのカテコールアミンの酸化に起因するスパイク状電流の発生頻度を増加させた。
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[Publications] Norio Katoh: "Enhancement by ganglioside GT1b of annexin 1 phosphorylation in bovine mammary gland in the presence of phosphatidylserine and Ca^<2+>." Lipid. 31. 983-987 (1996)
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[Publications] Takeshi Sugawara: "Tacrine inhibits nicotinic secretory and current responses in adrenal chromaffin cells." European Journal of Pharmacology. 319. 123-130 (1996)
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[Publications] Naoki Kitamura: "Calcium channel subtypes in porcine adrenal chromaffin cells." Pfluger Arch-European Journal of Physiology. 434. 179-187 (1997)
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[Publications] Shigeo Ito: "Measurement of intracellular Na^+ concentration by a Na^+-sensitive flourescent dye,sodium-binding benzofuran isophthalate,in porcine adrenal chromaffin cells:usage of palytoxin as a Na^+ ionophore." Journal of Neuroscience Methods. 75. 21-27 (1997)
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[Publications] Shigeo Ito: "Changes in intracellular Na^+ concentration evoked by nicotinic receptor activation in the guinea-pig adrenal chromaffin cells." Neuroscience Letters. 238. 1-4 (1997)
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[Publications] Toshio Ohta: "Ca^<2+>-dependent K^+ currents induced by muscarinic receptor activation in guinea pig adrenal chromaffin cells." Journal of Neurochemistry. 70. 1280-1288 (1998)
