牛未成熟卵母細胞の凍結融解後の体外受精胚作出と移植による子牛生産技術の確立

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07556123
• Section: 試験
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 鈴木 達行 山口大学, 農学部, 教授 (00216409)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤原 昇 九州大学, 農学部, 教授 (60150512)
• Keywords: 牛 / 未成熟卵母細胞 / エチレングリコール / トレファロース / PVP / 凍結保存 / 移植 / 産子

Research Abstract

細胞への透過性の高い1.8Mエチレングリコール(EG)、1.3Mエチレングリコール モノ メチルエーテル(EME)と1.6M 1,2プロパネダイオール(PROH)に様々な濃度でトレファロース(T)とポリビニールピロリドン(PVP)を添加して実験に供した.GV期の牛卵母細胞を1.8MEGと5%PVPの混合液に0.05Mトレファロース(T)を添加した溶液で凍結融解後体外受精したとき77.8%がメタフェース、22.2%が変性細胞であったが、単為発生はみられなかった.体外受精率は1.8MEG+0.05MTまたは0.1MT溶液で処置したものが1.8MEG+0.2MTまたはTを含まない溶液で処置したものよりも高かった.しかし、正常受精と多精子侵入は各凍結保護剤間に差異はみられなかった.またGV期卵母細胞の凍結保護剤として用いたEG、EMEとPROHでは、その後の胚発生に差がみられなかった.この場合0.05Mまたは0.1MTを添加したもののほうが0.2MTまたはTを含まない溶液よりも胚分割率、胚盤胞胚発生率が高かった.凍結処置しないGV期の卵分割ならびに胚盤胞胚発生率は凍結処置したものよりも高かった(P<0.01).1.8MEG+0.05MTに5%のPVPを添加し凍結融解した例では10%と20%PVPを添加した例に比べて胚盤胞への発生率が有意に高かった.このようにして作出した胚を二重蛍光染色法により受精8日目胚の細胞数を分析したところコントロールと凍結融解卵母細胞別に胚結節がそれぞれ30.1±6.6と27.6±5.9,栄養膜細胞がそれぞれ79.3±21.3と77.9±33.2となり両者に差異がみられなかった.この実験で作出された胚盤胞胚を5頭の受胚牛に2個ずつ移植した結果4頭が受胎し、1対の双子と2頭の単子が得られた.現在ガラス化保存法の有効性についても検討している.

Research Products

• [Publications] Suzuki T: "Calves obtained after transfer of frozen-thawed bovine immakture oocytes cryopreservation in various cryoprotectants" Theriogenology. 45.1. 361-361 (1996)
• [Publications] Suzuki T: "Fertilization and development of frozen-thawed germinal vesicle bovine oocytes by a one-step dilution method in vitro" Cryobiology. 33. 515-524 (1996)
• [Publications] 鈴木達行: "凍結融解した牛卵母細胞(GV期)の体外受精から得られた産子" 野生動物の家畜化と改良 養賢堂出版、249頁. 172-175 (1996)