1995 Fiscal Year Annual Research Report
キャピラリー電気泳動法を用いた遺伝子診断の自動化の開発
Project/Area Number |
07557017
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Research Category |
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
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Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
Principal Investigator |
湯浅 保仁 東京医科歯科大学, 医学部, 教授 (80111558)
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Keywords | キャピラリー電気泳動 / 遺伝子診断 / PCR / 突然変異 / マイクロサテライト / 大腸癌 |
Research Abstract |
キャピラリー内にゲルをつめる代わりに、ポリマーを含む緩衝液によって分子ふるい効果を持たせたNon-Gel Sieving法によるPCR産物分析の至適条件を検討した。HPMC(Hydoxy Propyl Methylcellulose)などのポリマーを緩衝液に溶かし、分離を行う際のポリマーの種類、濃度を検討し、1-50bpおよび100-2000bpのDNAを分離するための至適条件を設定した。一方、電気浸透流を少なくするためのキャピラリー内壁のコーティングについても検討した。Linear Polyacrylamideなどをコーティングすることにより電気浸透流を少なくでき、内径50μm程度の細いキャピラリーを用いても良好にDNAを分離できることが判明した。 PCR産物は、反応液に含まれるヌクレオチドや塩などの影響により、通常は精製しなければキャピラリー電気泳動で分析できない。そこで、PCR反応におけるヌクレオチドやプライマー濃度、更には電気泳動の緩衝液濃度を検討し、PCR産物を精製せずに分析できる条件を設定した。この条件でPCR産物をキャピラリー電気泳動にて分析し再現性を検討したところCVは0.7%以下であり、また最小検出感度は5-20pgであることが判明し、遺伝子診断の検査に充分利用できると考えられた。 次に、c-H-rasやc-K-ras遺伝子を対象にしてPCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法、LCR(Ligase Chain Reaction)法による点突然変異検出系を開発した。臨床検体を用い従来のゲル電気泳動法との比較を行ったところ、分離能、感度、再現性共に従来法と同等以上であった。またCA repeatsを指標にしたMicrosatellite Instabilityを検出できる系を開発、同様に臨床検体の解析を行った。大腸癌臨床検体等を対象として検討したところ、1検体当たり10-15分程度で従来の方法と同等以上の感度分離能で解析できた。以上によりキャピラリー電気泳動を用いた遺伝子診断技術の基本的な条件が確立された。
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Research Products
(8 results)
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[Publications] Oto,M.,et al.: "Microsatellite instability in cancer identified by non-gel sieving capillary electrophoresis." Clinical Chemistry. 41. 482-483 (1995)
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[Publications] Oto,M.,et al.: "DNA hybridization analysis of PCR products by non-gel sieving capillary electrophoresis." PCR Methods & Applications. 4. 303-304 (1995)
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[Publications] Oto,M.,et al.: "Indenitfication of mutated p53 in cancer by non-gel sieving capillary electrophoretic SSCP analysis." Clinical Chemistry. 41. 1787-1788 (1995)
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[Publications] Wu,C.,et al.: "Polymorphisms and proble lack of mutation in a human mutT homolog,hMTH1,in hereditary nonpolyposis colorectal cancer." Biochem.Biophys.Res.Commun.214. 1239-1245 (1995)
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[Publications] Lu,S.-L.,et al.: "Mutations of the transforming growth factor-β type II receptor gene and genomic instability in hereditary nonpolyposis colorectal cancer." Biochem.Biophys.Res.Commun.216. 452-457 (1995)
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[Publications] Homma,M.K.,et al.: "Growth inhibition by phospholipase C inhibitor peptides of colorectal carcinoma cells derived from familial adenomatous polyposis." Cell Growth & Differentation. (in press).
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[Publications] ed.Baba,S.,et al.: "A New Strategy for Treatment of Hereditary Colorectal Cancer." Churchill Livingstone Japan(in press),
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[Publications] 古庄湯浅 他 編集: "臨床DNA診断法" 金原出版, 1134 (1995)