カブトガニの体液凝固カスケードを活用した真菌類の高感度検出法の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07557021
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 牟田 達史 九州大学, 理学部, 助手 (60222337)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 重則 生化学工業(株), 試薬診断薬事業部, グループリーダー(主 ; 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037) ; 岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
• Keywords: β-グルカン / 異物認識 / 体液凝固 / 無脊椎動物 / カブトガニ / 真菌 / 検出法 / 生体防御

Research Abstract

まず、FactorGの両サブユニットのcDNAを昆虫細胞用のtransferベクター内に挿入し、これをbaculovirusDNAとともに昆虫細胞にtransfectionし、homologous recombinationによりcDNAを含む組み換えvirusを作製した。このvirusを昆虫細胞に感染させ、細胞および培養上清中に含まれるタンパク質をSDS電気泳動によって検討したところ、両サブユニットについて予想される分子量の位置にバンドが観察された。さらにこのバンドを各サブユニットに対して特異的な抗体を用いてWestern blottingを行ったところ、それぞれサブユニットα、βそのものであることが確認された。
こうして得られたサブユニットαを用いて、その多糖結合活性を検討したところ、サブユニットαは単独でlaminarinなどのβ-グルカンに結合する活性を示した。そこでサブユニットαの特徴的な三つのドメインをそれぞれ発現させ、多糖結合活性をみると、C末端のXylanaseZ様ドメイン内にβ-グルカン結合活性が局在していることが証明できた。
本年度は当初の目的どおり、両サブユニットの昆虫細胞内での発現に成功し、さらに発現したサブユニットα、およびその各ドメインを用いて、多糖結合ドメインがサブユニットα内のXylanaseZ様ドメイン内に存在することが初めて証明できた。この多糖に結合するドメイン構造をさらに細かく検討することにより、β-グルカン認識にかかわる最小のポリペプチド構造が明らかにできると期待される。

Research Products

• [Publications] Muta,T.: "Purified Horseshoe Crab Factor G" J.Biol.Chem.270. 892-897 (1995)
• [Publications] Nishimura,H.: "cDNA and deduced amino acid sequence of human PK-120,aplasma kallikrein-sensitive glycoprotein." FEBS Lett.357. 207-211. (1995)
• [Publications] Muta,T.: "Clotting and immune defense in Limulidae." Progress in Molecular and Subcellular Biology. in press. (1996)
• [Publications] Muta,T.: "The role of hemolymph coagulation in innate immunity." Curr.Opin.Immunol.in press. (1996)
• [Publications] 牟田 達史: "真菌の細胞壁成分によって活性化される新しいセリンプロテアーゼ前駆体" 生化学. 67. 1032-1036 (1995)
• [Publications] 牟田 達史: "B細胞の活性化制御とFcレセプター" 臨床免疫. 27. 1164-1170 (1995)