膵癌関連抗原と癌抑制遺伝子のimmuno-PCR法を用いた超高感度検出法の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07557046
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 今井 浩三 札幌医科大学, 医学部, 教授 (60117603)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 日野田 裕治 札幌医科大学, 医学部, 助教授 (10165128)
• Keywords: Immuno-PCR / 膵癌 / MUSE11抗原

Research Abstract

2つのモノクローナル抗体を用いたsoluble intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)の検出系にimmuno-PCRを応用し、基礎的検討を行った。標準抗原として、ヒト膵癌細胞株Panc-1の培養上清を、臨床検体として胃癌患者血清を使用した。ビオチン化二次抗体にアビジンを介して、ビオチン化cDNA(253bp)を結合させ、このcDNAをPCR法にて増幅した。その結果、抗原を含まない陰性対照でもDNAの増幅を認めた。この原因を種々検討したところ、ビオチン化二次抗体あるいはストレプトアビジンが非特異的に反応するため、それにビオチン化DNAが結合し増幅されることが明らかとなった。またこの非特異反応は加えるビオチン化DNA量にも依存し、DNA量を10^5コピー/mlまで低下させると出現しないことを明らかにした。DNA量は少なすぎると感度も低下するため、その測定系により微調整する必要があると考えられた。このようにして確立した測定系で標準抗原を測定すると、ELISAの検出限界が44単位であったのに対し、immuno-PCR法では10^3倍(0.044単位)まで検出感度が増加した。
同一条件で膵癌関連抗原MUSE11(MUC1)について測定を試みた。抗原はMUC1 cDNA断片より作製した組換え蛋白を用いた。その結果、10^2倍の測定感度が得られており、現在多数の血清および膵液検体について検討を加えている。血清検体は、組換え蛋白や膵液検体に比較して、非特異反応が出やすく、過塩素酸などを用いた除蛋白操作が必要と考えられる。

Research Products

• [Publications] Suzuki,A.,et al.: "Double determinant immuno-polymerase chain reaction:A sensitive method for detecting circulating antigens in human sera." Jpn.J.Cancer Res.86. 885-889 (1995)
• [Publications] 今井浩三 他: "Immuno-polymerase chain reaction(Immuno-PCR)を用いた微量抗原検出." 蛋白質核酸酵素. (in press). (1996)
• [Publications] Itoh,F.,et al.: "Double determinant immuno-polymerase chain reaction for detecting sICAM-1." Areificial Organs. (in press). (1996)
• [Publications] Arima,K.,et al.: "Clinical significance of soluble ICAM-1 antigen in sera of patients with various liver diseases." Tumor Res.(in press). (1996)
• [Publications] Shijubo,N.,et al.: "Soluble ICAM-1 in sera and bronchoalveplar lavage fluids of extrinsic allergic alveolitis." Clin,Exp.Immunol.102. 91-97 (1995)