神経変性疾患病態解明のためのヒト脳組織タンパク質データベースの作製とその応用

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07557051
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 下濱 俊 京都大学, 医学研究科, 助手 (60235687)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 角野 冨三郎 (株)エムエステクノシステムズ, 主任研究員 (50029964) ; 藤本 貞毅 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (80090182)
• Keywords: 二次元電気泳動法 / データベース / 脳 / 神経変性疾患 / アルツハイマー病 / タンパク質 / GFAP / βアクチン

Research Abstract

本研究では、高分解能二次元電気泳動法を用い、最新のコンピューターによる解析システムを組み合わせ、二次元電気泳動で得られるタンパクスポットのデータベース化を行う。これによって、従来、主に細胞を対象に行われていたこの方法を、当施設のbrain bankに保存されている神経変性疾患の脳組織について応用し、疾患特異的なタンパクの変化を検出し、同定するのが目的である。平成8年度までの研究では、脳組織を試料とした二次元電気泳動法の標準化、これを用いた二次元データベースの作成とその解析を行った。平成9年度の研究では例数を増やしてさらに検討を加え、増加するスポット5個、減少しているもの28個、アルツハイマー病のみに出現しているスポット7個を確定した。スポットの同定にはタンパクを抽出し直接アミノ酸配列を調べる方法が確実だが、必要なタンパク量が多く、また脳タンパクはN端がブロックされていることが多いため、二次元泳動ゲル上のスポットの同定には限界がある。これに対し抗体を用いる方法は転写膜上のタンパクスポットとゲル上のタンパクスポットを正確にマッピングする方法がなく、同定にエラーが起こりやすかった。私達は転写膜をあらかじめ金コロイド染色でタンパク染色を施した後、特異抗体で反応するスポットをECL法を用いて検出した。金コロイド法を用いることで銀染色による従来のデータと対照することが可能となり、またECL法を用いることで同一の膜で複数の抗体に反応するスポットを確認することができる。この方法でGFAPとβアクチンのスポットを二次元データベース上に確認し、増加するスポット1個と減少するスポット1個がGFAPであることを特定した。本研究で確立したアルツハイマー病脳タンパクデータベースは今後インターネット上に公開して他施設での利用に役立てるとともに、その結果を取り入れてデータベースとしての内容の拡充を図りたい。

Research Products

• [Publications] Kitamura Y et al: "Alteration of proteins regulating apoptosis,Bcl-2,Bcl-x,Bax,Bak,Bad,ICH-I and CPP32,in Alzheimer's disease" Brain Res. 780. 260-269 (1998)
• [Publications] Imura T et al: "Genetic variation in the ciliary neurotrophic factor receptor alpha gem and familial amyotrophic lateral sclerosis" Ann Neurol. 43. 275- (1998)
• [Publications] Shimohama S et al: "Phospholipase C isozymes in the human brain and their changes in Alzheimer's disease" Neuroscience. 82. 999-1007 (1998)
• [Publications] Kitamura Y et al: "Alteration of transcription factors NF-Kappa B and STATI in Alzheimer's disease brains" Neurosci Lett. 237. 17-20 (1997)
• [Publications] Shimohama S et al: "Ditterential involvement of synaptic vesicle and presynaptic plasma membrane proteins in Alzheimer's disease" Biochem Biophys Res Commun. 236. 239-242 (1997)
• [Publications] Kitamura Y et al: "Changes of p53 in the brains of patients with Alzheimer's disease" Biochem Biophys Res Commun. 232. 418-421 (1997)