1995 Fiscal Year Annual Research Report
ヒト代謝酵素cDNAの安定かつ高発現系の開発と代謝動態予測システムへの利用
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07557149
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Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
山添 康 東北大学, 薬学部, 教授 (00112699)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
熊谷 博道 旭硝子株式会社, 中央研究所, 主任研究員
田井中 均 アマシャム株式会社, 総合研究所, 研究員
鈴木 真也 東北大学, 薬学部, 教務職員 (40196829)
永田 清 東北大学, 薬学部, 助手 (80189133)
出川 雅邦 東北大学, 薬学部, 助手 (50134002)
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| Keywords | 薬物代謝 / チトクロームP450 / cDNA発現 |
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| Research Abstract |
ヒト肝のcDNAライブラリーから単離したチトクロームP450分子種のcDNA(CYP2C9)をヒトサイトメガロウイルスのプロモーターを含む発現に組込み、S.pombe酵母を形質転換させた。G418選択マーカーによって目的クローンを選択し、さらにP450の発現を間接蛍光抗体法で確認した。得られたクローンのP450発現の効率に差が認められたので、培養条件の検討を行った。
3種の培地(YEL,YPD,SD)とpHおよび菌体濃度の関連を比較した結果、late stationaryになると細胞が堅くなり、Zymolyase処理の効率が低下し、P450のレベルも低下することがわかった。これらの結果からYPD培地で初発の100倍である1×10^8個/ml程度に増殖した時点で最も効率よく回収できることがわかった。この条件で調製したCYP2C9の発現量は、約0.2nmol/mg蛋白とかなりの高い値が得られた。ついで薬物代謝能を調べたところ、CYP2C9はKm83.3μM,Vmax330pmol/nmol P450/minの値を示し、しかもこの活性はスルファフェナゾール添加によって阻害された。これらのデータからS.pombe発現系はヒト薬物代謝の代替系として十分に機能しうることが確認された。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] S. Ozawa: "Primary structures and properties of two related forms of aryl sulotransferases′in human liver" Pharmacogenetics. 5. S135-S140 (1995)
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[Publications] M. Shimada: "Age- and sex- related alterations of microsomal Drug- and testosterone-oxidiizing cytochrome P450 in Sprague-Dawley strain-derived dwarf ras" J. Pharm. Exp. Ther.275. 972-977 (1995)
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[Publications] K. Nagata: "Isolation and chracterization of a new rat P450(CYP2C18) cDNA encoding P450_<6β-2> catalyzing testosterone 6β- and 16α-hydroxylations" Pharmacogenetics. 6. 103-112 (1996)
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[Publications] K. P. Vatis: "Nomenclature for N-acetyltransferase" Pharmacogenetics. 5. 1-17 (1995)
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[Publications] Y. Yamazoe: "Structure and function of sulfotransferases, In advaces in Drug Metabolism in Man" European Commission Publishing, 20 (1995)
