1995 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
07557151
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
長尾 拓 東京大学, 薬学部, 教授 (30217971)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野又 康博 栄研化学(株), 生物化学研究所, 主任研究員
黒瀬 等 東京大学, 薬学部, 助手 (10183039)
|
|---|
| Keywords | 受容体キナーゼ / モノクローナル抗体 / 抗体遺伝子 / 細胞内発現 |
|---|
| Research Abstract |
遺伝子クローニング技術の進展は、受容体を含む多くのタンパク質がいくつかのサブタイプから成っていることを明らかにした。しかしながら、個々のタンパク質が細胞内でどのような機能を果たしているのかについては従来の方法では明らかにされない。本研究では、個々の遺伝子産物を認識する単クローン抗体を細胞内に発現させ、目的とするタンパク質の活性を不活化させ、そのタンパク質の機能を細胞レベルで解析できる系を確立することを目的としている。まず、マウスを免疫するために、受容体キナーゼの間で相同性の低いカルボキシ末端とグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質を作製した。受容体キナーゼIIのカルボキシ末端より約100アミノ酸をPCR法により増幅し、GSTとの融合タンパク質を大腸菌に発現させた。しかし、予期しなかったことにほとんど全ての融合タンパク質は不溶性画分にあった。不溶性画分より可溶化するいくつかの方法を試みたが、収量を増加させることはできなかった。次に、カルボキシ末端より約200アミノ酸をPCR法により増幅しGSTとの融合タンパク質を作製した。この融合タンパク質は可溶性画分に回収されたので、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができた。この融合タンパク質を用いてマウスに免疫し、ミエローマ細胞との融合を行った。ハイブリドーマをスクリーニングした結果、一つのクローンが得られた。このモノクローナル抗体の抗原決定部位は、カルボキシ末端より100から200アミノ酸部分に存在することが明らかになった。現在、このモノクローナル抗体が受容体キナーゼIIの作用を抑制するのかどうか解析している。
|
