DNA複製に関与するDNAヘリカーゼを標的とする阻害剤の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07557153
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 榎本 武美 東北大学, 薬学部, 教授 (80107383)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥山 彬 萬有製薬, つくば研究所, 部長 ; 関 政幸 東北大学, 薬学部, 助手 (70202140)
• Keywords: DNA複製 / DNAヘリカーゼ / DNA依存性ATPase / 阻害剤 / スクリーニング / 抗癌剤 / 哺乳類細胞

Research Abstract

本研究は哺乳類細胞のDNA複製に関するDNAヘリカーゼを同定し、このヘリカーゼの活性を特異的に阻害する阻害剤のスクリーニング系を開発し、新たな抗癌剤開発の基礎を提供することを目的としたものである。
スクリーニング系の開発では、DNAヘリカーゼ活性をDNA依存性ATPase活性に置き換え、96穴のプレートで吸光度によりATPase活性を測定する系を作ることができ、多数の検体を処理できるスクリーニング系を開発することができた。
我々は、DNA複製の温度感受性変異株を分離し解析することにより、DNAヘリカーゼBがDNA複製に関与するDNAヘリカーゼであることを示唆してきたが、本研究で、精製したDNAヘリカーゼBやcell-freeのDNA複製系を用いて、DNAヘリカーゼBがDNAプライマーゼ活性を促進することやcell-free系で機能することを明らかにし、機能の面からもDNAヘリカーゼBが哺乳類細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼであることを示すことができた。
さらに、DNAヘリカーゼBのcDNAのクローニングを試み、cDNAの全長をクローニングすることができた。この哺乳類細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼBをスクリーニング用に安定に供給するため、このcDNAを用いてDNAヘリカーゼBの大腸菌での大量発現系の構築を試みたが、活性のあるDNAヘリカーゼBを大量に発現させることはできなかった。現在ヴァキュロウイルスを用いた大量発現系の構築を試みている。

Research Products

• [Publications] Masayuki Seki: "Characterization of DNA synthesis and DNA-dependent ATPase activity at the restrictive temperature in temperature-sensitive mutants,tsFT848 cells with thermolabile DNA helicase B" Molecular and Cellular Biology. 15. 165-172 (1995)
• [Publications] Akiko Saitoh: "Stimulation of mouse DNA primase-catalyzed oligoribonucleotide synthesis by mouse DNA helicase B" Nucleic Acids Research. 23. 2014-2018 (1995)
• [Publications] Ken Matsumoto: "Stimulation of DNA synthesis by mouse DNA helicase B in a DNA replication system containing eukaryotic replication origins." Biochemistry. 34. 7913-7922 (1995)
• [Publications] Toshihiko Eki: "Efficient replication of polyomavirus DNA in a cell-free system supplemented with Escherichia coli single-stranded DNA binding protein, which exhibits species-specificity in" Journal of Biochemistry. 118. 435-441 (1995)