1995 Fiscal Year Annual Research Report
cDNA導入による安定細胞系の確立と創薬のための薬物効果判定モデルの作製
Project/Area Number |
07557195
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Research Category |
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
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Research Institution | Kumamoto University |
Principal Investigator |
宮本 英七 熊本大学, 医学部, 教授 (50109659)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 秀幸 熊本大学, 医学部, 講師 (60191433)
福永 浩司 熊本大学, 医学部, 助教授 (90136721)
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Keywords | CaMキナーゼ / PC12細胞 / 遺伝子強制導入 / 安定クローン細胞 / 神経突起伸展反応 / カルシウムイオン / ジブチリルcAMP / 自己燐酸化反応 |
Research Abstract |
マウス脳CaMキナーゼIIαサブユニット(CaMキナーゼIIα)のcDNAを,動物細胞の発現ベクター(pCAGGSneo)に組み込み,PC12細胞に,電気パルス法で強制導入した。ネオマイシンを含む培地で継代培養し,CaMキナーゼII活性が上昇した複数の安定クローン細胞を確立した。CaMキナーゼIIのcDNAを持たないベクターを強制導入したMock細胞を対照細胞とした。1)CaMキナーゼIIα,β,γ,δ4種類のサブユニットcDNAを用いたノーザンブロット法により,PC12細胞に存在する約52kDaの内在性CaMキナーゼIIは,γとδサブユニットであることが明らかになった。2)安定クローン細胞では,ノーザンブロット法およびイムノブロット法により,CaMキナーゼII活性に応じたCaMキナーゼIIαの発現が確認された。3)細胞を[^<32>P]正燐酸でラベルし,Ca^<2+>イオノフォアであるイオノマイシンで刺激した後,0.1%トリトンX-100を含むRIPA緩衝液でホモジナイズし,免疫沈降法にてCaMキナーゼII自己燐酸化反応を検討した。イオノマイシン2μM,5分間の刺激により内在性CaMキナーゼIIと過剰発現したCaMキナーゼIIαの自己燐酸化反応が増強した。4)いずれの細胞でもCa^<2+>/カルモデュリン非依存性活性が,イオノマイシン刺激によって約4倍上昇した。このことは,発現したCaMキナーゼIIが,細胞質内Ca^<2+>濃度の上昇により内在性CaMキナーゼIIと同様に活性化されることを示している。5)安定クローン細胞を用いて,ジブチリルcAMP(dbcAMP)刺激による神経突起伸展反応について検討した。いずれの細胞もdbcAMPを加えないときは,神経突起伸展をほとんど認めなかった。1mM dbcAMP投与後24時間において,CaMキナーゼIIαを発現した細胞では,CaMキナーゼII活性に依存して神経突起伸展反応が抑制された。
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Research Products
(7 results)
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[Publications] K.Fukunaga: "Increased phosphorylation of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II and its endogenous substrates in the induction of long-term potentiation" J.Biol.Chem.270. 6119-6124 (1995)
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[Publications] M.Morioka: "Glutamate-induced loss of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II activity in cultured rat hippocampal neurons" J.Neurochem.64. 2132-2139 (1995)
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[Publications] H.Yamamoto: "Phosphorylation of myristoylated alanine-rich C kinase substrate (MARCKS) by proline-directed protein kinases and its dephosphorylation" J.Neurochem.65. 802-809 (1995)
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[Publications] M.Kurino: "Activation of mitogen-activated protein kinase in cultured rat hippocampal neurons by stimulation of glutamate receptors" J.Neurochem.65. 1282-1289 (1995)
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[Publications] K.Matsumoto: "Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II and synapsin I-like protein in mouse insulinoma MIN6 cells" Endocrinology. 136. 3784-3793 (1995)
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[Publications] H.Yamamoto: "Dephosphorylation of fetal-tau and paired helical filaments-tau by protein phosphatases 1 and 2A and calcineurin" J.Biochem.118. 1224-1231 (1995)
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[Publications] 宮本英七: "蛋白キナーゼ.Atlas of Brain Mechanisms of Mind & Behavior.精神活動の流れを遡る -機能・構造・物質-(早石 修・伊藤正男 編)" メディカル・ジャーナル社, 3 (1995)